叢賈囡，鄭慶范，朱學(xué)偉*，段偉娜,3，楊壽君

(1.長春市中心醫(yī)院 眼科，吉林 長春130062；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

變應(yīng)性鼻炎(過敏性鼻炎，AR)的發(fā)病率不斷增高[1-3]，環(huán)境及病毒感染等成為重要的相關(guān)影響因素[4-6]。研究顯示，包括EB病毒(EBv)以及鼻病毒等因素可能參與變應(yīng)性鼻炎及哮喘的調(diào)節(jié)，可能通過促進(jìn)Th2方向IL-4以及IL-13等細(xì)胞因子的表達(dá)，參與到變應(yīng)性鼻炎以及哮喘的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中[7]。EB 病毒主要特征基因潛伏膜蛋白1(LMP1)轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細(xì)胞能夠促進(jìn)其高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達(dá),鼻黏膜局部釋放的HMGB1可以促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的存活及炎性介質(zhì)的釋放[8]。RAGE是HMGB1作用的受體，胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)可能是參與HMGB1調(diào)節(jié)的下游蛋白信號[9]。本研究擬通過制備LMP-1重組質(zhì)粒，并滴鼻觀察其對變應(yīng)性鼻炎鼠模型鼻黏膜組織RAGE，HMGB1及TSLP等免疫調(diào)節(jié)信號表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討病毒感染對變應(yīng)性鼻炎及哮喘發(fā)作的免疫學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用BALB/c小鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，雌雄各20只，均為8到10周齡，體重在20至25 g，12 h間斷照明飼養(yǎng)。造模致敏用卵清蛋白(OVA)和氫氧化鋁膠為美國Sigma公司產(chǎn)品。

LMP-1插入片段大小為1 161 bp，Gene ID:378750。LMP-1重組質(zhì)粒及脂質(zhì)體由中國公共蛋白及質(zhì)粒實驗室(PPL)制備。鼠源性的RAGE，HMGB1及TSLP為RD公司產(chǎn)品。二抗及免疫印跡試劑盒為公司產(chǎn)品。

1.2 分組、致敏及給藥

將40只BALB/c鼠分為兩組，即AR模型組及質(zhì)粒組，每組 20只鼠。兩組動物在第0、7、14天先給予20 μg OVA及氫氧化鋁腹腔注射。然后每側(cè)鼻腔給予5% OVA10 μl滴鼻激發(fā)，連續(xù)5天。之后，AR模型組動物連續(xù)兩天給予20 μl空白脂質(zhì)體滴鼻，質(zhì)粒組連續(xù)兩天給予20 μl脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒(質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例1∶2.5，濃度為0.25/μl)[10]。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測

取材獲得AR組及質(zhì)粒組動物的鼻黏膜組織，進(jìn)行WB檢測。組織經(jīng)過裂解液RIPA裂解，變性。然后將兩組獲得的組織樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)到PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，分別加入鼠源性的RAGE，HMGB1及TSLP的IgG一抗(1∶200)孵育60 min。加入稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，具體操作參照試劑盒進(jìn)行。使用BeyoECL Plus(P0018)顯影成像。內(nèi)參照物為β-Actin。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，統(tǒng)計學(xué)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

兩組動物經(jīng)OVA滴鼻激發(fā)后均產(chǎn)生噴鼻、抓鼻等鼻變態(tài)反應(yīng)的表現(xiàn)。Western blot結(jié)果顯示，與AR模型組比較，LMP-1重組質(zhì)粒組小鼠鼻黏膜組織HMGB1、RAGE及TSLP高表達(dá)，質(zhì)粒組顯著高于AR模型組表達(dá)水平，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05),結(jié)果見表1。

表1 2組小鼠鼻黏膜組織HMGB1，RAGE以及TSLP表達(dá)

3 討論

HMGB1 是一種在哺乳動物組織細(xì)胞核內(nèi)豐富表達(dá)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,也是一種重要的炎性介質(zhì)啟動信號，相關(guān)研究證實其在鼻咽癌細(xì)胞高表達(dá)[11]。Leonardo Cavone 最新研究發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎患者鼻腔分泌物中HMGB1表達(dá)水平增加，HMGB1 能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的存活及炎性介質(zhì)的釋放，從而促進(jìn)了鼻變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生和放大，是調(diào)節(jié)鼻黏膜 Th2 反應(yīng)的重要信號。此外，NARES 及鼻息肉患者鼻腔分泌物中HMGB1水平也高于健康對照。甘草酸(GLT)通過與 HMGB1 結(jié)合可降低鼻變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)度。同時，布地奈德噴鼻也可降低鼻炎患者的鼻腔分泌物中 HMGB1 的水平。GLT 和布地奈德對 HMGB1抑制后，鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞活性被抑制，炎性介質(zhì)的釋放明顯降低，鼻腔癥狀也被控制[12]。

對鼻變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度的正向調(diào)節(jié)因素較少。本研究結(jié)果顯示，LMP-1重組質(zhì)粒組小鼠鼻黏膜組織RAGE，HMGB1與AR模型組比較高表達(dá)，證實EB 病毒主要特征基因潛伏膜蛋白 1可能是正向調(diào)節(jié)Th2方向鼻變態(tài)反應(yīng)的重要因素之一。此外，TSLP的Western blot結(jié)果顯示其在質(zhì)粒組鼠模型鼻黏膜組織高表達(dá)，與AR模型組對照比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)。之前的研究證實，變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜上皮細(xì)胞中 TSLP 高表達(dá)，并且與癥狀評分以及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)相關(guān)，TSLP在過敏性鼻炎鼻黏膜組織高表達(dá)與鼻變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)度正向相關(guān)，可能是放大、調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎強(qiáng)度的關(guān)鍵信號[13]。本研究結(jié)果證實HMGB1的表達(dá)水平與TSLP表達(dá)也具有一定的相關(guān)性，在調(diào)節(jié)過程中也存在潛在的相互聯(lián)系。老年人的變應(yīng)性鼻炎(AR)由于老年人免疫應(yīng)答能力下降,老年AR病人的免疫學(xué)表現(xiàn)及臨床干預(yù)手段應(yīng)該特殊考慮[14]。對于那些合并哮喘，心臟病及病毒感染的群體應(yīng)予以綜合分析[15]。然而,目前對于老年AR尚缺乏足夠的研究。本研究關(guān)注老年變應(yīng)性鼻炎群體可能存在的病毒感染因素進(jìn)行相關(guān)分子生物的檢測，希望對有關(guān)老年人的變應(yīng)性鼻炎診斷和治療的推薦意見提供一些幫助。

以往的研究多集中在鼻病毒對哮喘等下氣道變態(tài)反應(yīng)的影響,而缺少 病毒相關(guān)蛋白對變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜上皮的系統(tǒng)研究。EB病毒潛伏膜蛋白 1(LMP1)是 EB 病毒的重要特征性基因。研究中通過構(gòu)建質(zhì)粒，包裹脂質(zhì)體，滴鼻變應(yīng)性鼻炎動物模型鼻黏膜組織，進(jìn)而觀察該基因?qū)Ρ磉_(dá)相關(guān)蛋白的情況。研究通過設(shè)立對照組，采用Western的方法檢測變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜 HMGB1 表達(dá)水平。最新研究表明變應(yīng)性鼻炎患者鼻腔黏膜及分泌物中 HMGB1表達(dá)水平增加是鼻變態(tài)反應(yīng)中的關(guān)鍵信號。本研究檢測鼻黏膜上皮細(xì)胞胞內(nèi) HMGB1 水平的變化。并與對照組進(jìn)行比較分析。證實 EB 病毒的特征性基因 LMP1 及其蛋白產(chǎn)物刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生 HMGB1，鼻黏膜上皮細(xì)胞也是 HMGB1 的重要來源之一，參與了鼻變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生及放大作用。Receptor for advanced glycation end-products(RAGE)是 HMGB1的作用受體，TSLP是 HMGB1的下游蛋白。研究中也檢測鼻腔黏膜組織標(biāo)本中 RAGE 的表達(dá)情況。證實轉(zhuǎn)染LMP1 質(zhì)粒能夠上調(diào)RAGE的表達(dá)水平。證實其可能是參與該細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)靶點蛋白之一。

總之，EB 病毒主要特征基因潛伏膜蛋白 1誘發(fā)鼻變態(tài)反應(yīng)可能與病毒誘導(dǎo)的 HMGB1有關(guān)，EB 病毒 LMP1 蛋白可能誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞及其他免疫相關(guān)細(xì)胞釋放大量的 HMGB1，后者進(jìn)一步激活并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞內(nèi) TSLP等信號的強(qiáng)化，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的存活及炎癥介質(zhì)的釋放，從而加重鼻變態(tài)反應(yīng)。鼻黏膜上皮細(xì)胞可能是啟動鼻變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵靶細(xì)胞，本研究主要是初步證實鼻黏膜上皮細(xì)胞 EB 病毒關(guān)鍵蛋白對鼻變態(tài)反應(yīng)的誘導(dǎo)、增強(qiáng)作用，進(jìn)一步研究 LMP-1 刺激釋放的 HMGB1 在鼻變態(tài)反應(yīng)調(diào)節(jié)的機(jī)制是未來重要的研究方向。