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沙棘酵素功能成分及其體外抗氧化性能研究

2020-08-28 07:22金哲寧方晟沙如意毛建衛(wèi)
食品研究與開發(fā) 2020年17期
關(guān)鍵詞:有機(jī)酸沙棘酵素

金哲寧,方晟,*,沙如意,毛建衛(wèi),4

(1.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江紹興312000;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州310023;3.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州310023;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江紹興312000)

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料,經(jīng)多種有益菌通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性發(fā)酵產(chǎn)品,既保持了植物自身營(yíng)養(yǎng)成分、也含有乳酸菌等有益微生物及其代謝產(chǎn)生的功能性小分子物質(zhì)等,研究表明,可有效清除體內(nèi)過(guò)剩的活性氧自由基,在預(yù)防和治療因自由基誘發(fā)的疾病和抗氧化方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。目前關(guān)于食用植物酵素體外抗氧化性能的研究較多,且研究表明有機(jī)酸對(duì)食用酵素的抗氧化性能有重要影響。Liao等[4]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵的芒果汁酵素中有機(jī)酸種類、酚類等都較芒果原汁有所提高,且DPPH自由基清除能力也顯著增加;Ghosh等[5]研究表明乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸能夠使原料中酚類物質(zhì)溶出并呈游離態(tài),導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中總酚含量上升。蔣增良等[3]研究發(fā)現(xiàn)葡萄酵素具有良好的自由基清除能力,其原因可能歸咎于有機(jī)酸、多酚和維生素的協(xié)同作用;程勇杰等[6]認(rèn)為由于樹莓酵素中有機(jī)酸的作用使其對(duì)ABTS自由基的清除能力優(yōu)于藍(lán)莓酵素。氨基酸是影響食用酵素營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要成分之一,李新等[7]測(cè)定了20種氨基酸的體外抗氧化性能,發(fā)現(xiàn)半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸的ABTS自由基清除活性最強(qiáng),半胱氨酸還具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性和鐵還原能力。目前有學(xué)者對(duì)食用酵素蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了檢測(cè),并進(jìn)一步酸水解后分析其氨基酸種類及含量,但關(guān)于食用酵素中游離氨基酸的研究較少。程勇杰等[8]對(duì)拓樹小青果酵素、拓樹花酵素和拓樹葉酵素的氨基酸種類、含量及抗氧化性能進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)3種酵素的氨基酸含量豐富,總氨基酸含量分別為12.667、2.780、1.198 mg/mL,且氨基酸含量與抗氧化性能具有正相關(guān)性。

沙棘(Hippophae rharnnoides)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)的灌木或小喬木,又名沙棗、酸(醋)柳、黃酸刺和黑刺等,屬于“藥食同源”植物,其果實(shí)含有多種生物活性物質(zhì),藥理實(shí)驗(yàn)表明,具有抗腫瘤、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能等作用[9-10]。因此,從食用安全性和保健功效考慮,沙棘是開發(fā)食用植物酵素的優(yōu)良植物資源。在功能性食品領(lǐng)域,沙棘目前主要用于制作沙棘果汁、果醋、果酒、油等產(chǎn)品,附加值相對(duì)較低[11]。同時(shí),沙棘果實(shí)為漿果,柔軟多汁,耐貯性差,嚴(yán)重影響加工利用,而食用酵素產(chǎn)品加工尤其適于時(shí)令性強(qiáng)的農(nóng)產(chǎn)品在大規(guī)模采收后的產(chǎn)業(yè)化加工。沙棘酵素的研發(fā)是解決沙棘果保鮮期短、高值轉(zhuǎn)化難等問(wèn)題的有效新途徑,但目前關(guān)于沙棘酵素的研究報(bào)道較少。本研究以沙棘為主要原料制備食用植物酵素,探討其自然發(fā)酵過(guò)程中體外抗氧化性能、功能組分的變化,分析其有機(jī)酸和游離氨基酸的組成及含量,以期為沙棘酵素產(chǎn)品的精準(zhǔn)制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

呂梁野生沙棘鮮果:文水縣萬(wàn)家富貢梨專業(yè)合作社;發(fā)酵糖液:浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。α,α-二苯基-β-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、硝基四氮咪唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:美國(guó)Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸氫二鉀、磷酸、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、甲醇、鐵氰化鉀、無(wú)水乙醇、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸鈉、硝酸鋁、醋酸鉀、硫酸亞鐵、鹽酸、冰乙酸、水合茚三酮、乙二醇(均為分析純):上海展云化工有限公司。

LC-20A高效液相色譜儀:島津公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì):上海儀電分析儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì):上海佑科儀器儀表有限公司;Allegra X-12R型冷凍離心機(jī):美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;SW-CJ-1B超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘酵素的制備

用去離子水清洗沙棘鮮果表面去除雜質(zhì),自然晾干。沙棘和發(fā)酵糖液按質(zhì)量比3∶5混勻后,加入到已滅菌的玻璃瓶中密封,室溫下避光發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中,分別在第 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 天取樣,樣品于10 000 r/min離心10 min后,保留上清液待測(cè)。

1.2.2 超氧自由基清除能力的測(cè)定

采用PMS/NADH體系還原NBT法[12],50 μL樣品加入到 950 μL 磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4),然后加入1 mL 120 μmol/L的PMS(用0.1 mol/L的PBS配制,pH 7.4),1 mL 936 μmol/L 的 NADH(用 0.1 mol/L 的PBS配制,pH 7.4) 和 1 mL 300 μmol/L 的 NBT(用0.1 mol/L的PBS,pH 7.4配制)。在環(huán)境溫度下反應(yīng)5 min。以去離子水為參比溶液。在560 nm處測(cè)定吸光度。用同樣方法測(cè)定發(fā)酵60 d沙棘酵素及VC對(duì)照超氧自由基清除能力,樣品加入量為 15、30、45、60、75、90 μL。

式中:A0為空白對(duì)照液吸光度;A1為樣品測(cè)定管吸光度;A2為樣品本底管吸光度。

1.2.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定

采用Fenton法[13],125μL樣品加入到1.4mL6mmol/L的H2O2,加入0.6 mL 20 mmol/L的水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L的硫酸亞鐵,37℃下恒溫水浴1 h。以去離子水為參比溶液。在562 nm下測(cè)定吸光度。用同樣方法測(cè)定發(fā)酵60 d沙棘酵素及VC對(duì)照羥基自由基清除能力,樣品加入量為 60、120、180、240、300、360 μL。

式中:A0為空白對(duì)照液吸光度;A1為樣品測(cè)定管吸光度;A2為樣品本底管吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用DPPH甲醇溶液顯色法[14],25 μL樣品加入到4 mL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液中,再加入450 μL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.4),25℃下恒溫水浴30 min。以去離子水為參比溶液。在517 nm處測(cè)定吸光度。用同樣方法測(cè)定發(fā)酵60 d沙棘酵素及VC對(duì)照DPPH自由基清除能力,樣品加入量為6、12、18、24、30、36 μL。

式中:A0為空白對(duì)照液吸光度;A1為樣品測(cè)定管吸光度;A2為樣品本底管吸光度。

1.2.5 總酸含量的測(cè)定

總酸含量測(cè)定參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》[15]。取1 mL樣品,用去離子水稀釋至50 mL,搖勻。取10mL上述稀釋液于150mL錐形瓶中,加1%酚酞2滴~3滴。用0.001 mol/L的NaOH水溶液滴定至微紅色30 s不褪色為滴定終點(diǎn)。每組3次平行,根據(jù)檸檬酸溶液與樣品消耗的NaOH體積計(jì)算樣品中與檸檬酸當(dāng)量的總酸含量。

1.2.6 總游離氨基酸含量的測(cè)定

采用茚三酮比色法[16],移取0.5 mL樣品置于50 mL容量瓶中,加入5 mL乙酸鋅溶液和5 mL亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,定容,靜止沉淀后,過(guò)濾,棄去最初少量濾液。吸取1.0 mL試液于25 mL具塞試管中,加2 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.5),充分搖勻,加2 mL 3%茚三酮乙二醇溶液,搖勻。將試管同時(shí)置于沸水浴中,待水沸騰后精確計(jì)時(shí)15 min,取出試管置于冷水中冷卻至室溫,于567 nm處測(cè)定吸光度,代入回歸方程y=0.03x-0.036 9(R2=0.999 7)計(jì)算出試液中總游離氨基酸的濃度。

1.2.7 總黃酮含量的測(cè)定

采用三氯化鋁法[17],移取0.5 mL樣品置于10 mL容量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,待測(cè)。吸取1.0 mL試液于50 mL容量瓶中,加乙醇至總體積為15 mL,依次加入100 g/L硝酸鋁溶液1 mL,9.8 g/L醋酸鉀溶液1 mL,搖勻,加水至刻度,搖勻。靜置1 h。吸取待測(cè)試溶液1.0 mL,置于50 mL容量瓶中,加乙醇至總體積為15 mL,加水稀釋至刻度,搖勻后作為參比,于415 nm處測(cè)定吸光度,代入回歸方程y=0.573 6x-0.004 4(R2=0.999 9)計(jì)算出試液中總黃酮的濃度。

1.2.8 有機(jī)酸含量的測(cè)定

有機(jī)酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC),參考 Rodrigo等[18]的方法進(jìn)行。HPLC分離條件:色譜柱為AgilentTCC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.01 mol/L 的KH2PO4溶液(用磷酸調(diào) pH=2.7),流速 1 mL/min,柱溫20℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。待測(cè)樣品用0.01 mol/L的KH2PO4溶液(pH 2.7)稀釋 5 倍,0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

準(zhǔn)確稱取草酸標(biāo)準(zhǔn)品105 mg,用超純水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中,搖勻,即105 mg/L草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。相同的方法依次配制L-酒石酸、L-蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液,其質(zhì)量濃度分別為 104、108、9.30、100、992、992、994、1 020、9.90 mg/L。

1.2.9 游離氨基酸含量的測(cè)定

游離氨基酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法,參考輕工標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4356-2012《黃酒中游離氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法》[19]。HPLC分離條件:色譜柱為Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.02 mol/L乙酸鈉、乙腈、水梯度洗脫,流速1 mL/min,柱溫40℃,檢測(cè)波長(zhǎng)25 nm。樣品衍生及萃取凈化后經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

氨基酸混標(biāo)中的氨基酸均溶于0.1 mol/L鹽酸,除胱氨酸濃度為1.25 mmol/L外,天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、組氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的濃度均為2.5 mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部試驗(yàn)均平行進(jìn)行3次,試驗(yàn)結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式。采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、相關(guān)性分析及半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)計(jì)算,采用 Origin86軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中體外抗氧化性能的變化

2.1.1 發(fā)酵過(guò)程中超氧自由基清除能力的變化

超氧自由基在活性氧物質(zhì)如過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧的形成中起重要作用,主要損害細(xì)胞膜,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及亞微結(jié)構(gòu),并引起一系列有害的生化反應(yīng)[20]。發(fā)酵過(guò)程中超氧自由基清除能力的變化見圖1。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中超氧自由基清除能力的變化Fig.1 Changes in superoxide radical scavenging ability during fermentation

圖1中,沙棘酵素的超氧自由基清除能力隨發(fā)酵進(jìn)行逐漸升高,在50 d~60 d之間迅速上升(p<0.05),發(fā)酵60 d時(shí)清除率達(dá)到47.48%,相較發(fā)酵5 d時(shí)提高469.04%。說(shuō)明延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有利于沙棘酵素對(duì)超氧自由基清除率的提高。陳嶺等[21]研究發(fā)現(xiàn)石斛花酵素自然發(fā)酵過(guò)程中對(duì)超氧自由基的清除能力呈增長(zhǎng)趨勢(shì),發(fā)酵前后增加了14.4%,在56 d時(shí)達(dá)到最大值,清除率為55.90%,與本研究結(jié)果類似。

2.1.2 發(fā)酵過(guò)程中羥基自由基清除能力的變化

羥基自由基是生物體內(nèi)極具反應(yīng)性的自由基,它幾乎能與活細(xì)胞中任何生物大分子發(fā)生反應(yīng),且反應(yīng)速度極快,在自由基病理學(xué)上被認(rèn)為具有高度的損傷性[13,22]。發(fā)酵過(guò)程中羥基自由基清除能力的變化見圖2。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中羥基自由基清除能力的變化Fig.2 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation

圖2表明,沙棘酵素的羥基自由基清除能力在5 d~15 d之間快速提升(p<0.05),之后呈緩慢上升的趨勢(shì),在發(fā)酵60 d時(shí)達(dá)到最高,為67.80%,相較發(fā)酵5 d時(shí)提高了223.70%。張浩然等[23]研究發(fā)現(xiàn)沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中的羥基自由基清除能力在初期顯著上升后趨于穩(wěn)定,發(fā)酵40 d時(shí)達(dá)到最高的64.44%。Lacan[24]和Siddhuraju[25]研究表明有機(jī)酸、具有自由羥基的酚類物質(zhì)、A環(huán)或B環(huán)上有多羥基取代或有自由的3-羥基取代的黃酮化合物,都可以呈現(xiàn)出自由基清除能力。

2.1.3 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基,在乙醇溶液中顯深紫色,能吸收抗氧化物的電子而引起樣品顏色的改變,其褪色程度與接受電子數(shù)成正比[26]。DPPH自由基清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化性能的常用方法,試驗(yàn)驗(yàn)證其具有良好的敏感性[27]。發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力的變化見圖3。

如圖3所示,沙棘酵素的DPPH自由基清除能力隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而升高(p<0.05),發(fā)酵45 d后漸趨于穩(wěn)定,發(fā)酵60 d時(shí)清除率達(dá)到89.47%,相較發(fā)酵5 d時(shí)提高了34.75%。蔣增良等[28]研究表明葡萄酵素的DPPH自由基清除能力在前24 d內(nèi)從78.82%上升至88.15%,之后略有上升,第56 d時(shí)達(dá)到最高,清除率為88.71%,其變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果類似。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.3 Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation

2.2 發(fā)酵過(guò)程中功能成分的變化

沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中功能組分含量變化見表1。

表1 沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中功能組分含量變化Table 1 Changes in functional components of sea-buckthorn Jiaosu during fermentation

沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中總酸含量、總游離氨基酸含量及總黃酮含量總體均呈上升趨勢(shì),發(fā)酵60 d分別達(dá)到(32.493±0.64)、(3.059±0.07)、(0.570±0.01)mg/mL,相較發(fā)酵5 d時(shí)分別提高了927.19%、100.96%和376.60%。沙棘酵素的總酸含量發(fā)酵5 d~40 d之間快速增加(p<0.05),可能是因?yàn)橹参锊牧现兴嵝晕镔|(zhì)溶出以及微生物大量繁殖產(chǎn)生蘋果酸、乳酸等次生代謝產(chǎn)物[29];隨后,可能由于乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵,將多元酸轉(zhuǎn)變成一元酸,減緩了總酸含量的上升趨勢(shì)。薛淑龍等[30]研究發(fā)現(xiàn)竹葉酵素的總酸含量在發(fā)酵前40 d明顯上升,之后趨于穩(wěn)定。樊秋元等[31]研究發(fā)現(xiàn)黑加侖酵素的總酸含量達(dá)到26.5 mg/mL。沙棘酵素的總游離氨基酸含量在35 d之前變化明顯,40 d~50 d之間保持穩(wěn)定,55 d時(shí)又顯著上升(p<0.05)。沙棘酵素的氨基酸主要來(lái)源于植物材料中蛋白質(zhì)酶解、微生物代謝產(chǎn)物以及微生物細(xì)胞自溶[32]。沙棘酵素的總黃酮含量在發(fā)酵5 d~30 d之間呈不規(guī)則變化,之后隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升(p<0.05)??赡苁怯捎诎l(fā)酵前期黃酮類物質(zhì)部分氧化,而游離態(tài)的黃酮醇類物質(zhì)易與糖苷結(jié)合形成配糖體,同時(shí)又不斷水解[33]。周偏等[33]研究發(fā)現(xiàn)諾麗酵素自然發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量呈波動(dòng)形變化,發(fā)酵54 d時(shí),總黃酮含量達(dá)到最大的0.39 mg/mL。

2.3 功能成分與體外抗氧化性能的相關(guān)性

根據(jù)表2,沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中總酸含量和總游離氨基酸含量與超氧自由基清除率、羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率均呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),其中與DPPH自由基清除率為極強(qiáng)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.947和0.956,而與超氧自由基和羥基自由基清除率為強(qiáng)相關(guān)??傸S酮含量與羥基自由基清除率無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系,與超氧自由基清除率和DPPH自由基清除率均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.883和0.777。說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸、游離氨基酸等對(duì)沙棘酵素抗氧化性能有一定作用,黃酮類物質(zhì)也可能對(duì)抗氧化劑起到協(xié)同或者增效的作用,由于發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量遠(yuǎn)低于總酸和總游離氨基酸含量,本研究進(jìn)一步對(duì)沙棘酵素中有機(jī)酸和游離氨基酸的組成及含量進(jìn)行分析。

表2 發(fā)酵過(guò)程各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of 6 indices

2.4 有機(jī)酸種類及含量測(cè)定

圖4為有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品以及發(fā)酵60 d時(shí)沙棘酵素樣品有機(jī)酸的HPLC色譜圖。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的有機(jī)酸HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of organic acids standard and sample

從圖4可知,沙棘酵素中有機(jī)酸組成豐富,包括草酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸和乙酸。沙棘酵素的有機(jī)酸含量見表3。

表3 沙棘酵素的有機(jī)酸含量Table 3 Contents of organic acid in sea-buckthorn Jiaosu

由表3可見,發(fā)酵60 d的沙棘酵素總有機(jī)酸含量為(18.010±0.49)mg/mL,以 L-蘋果酸為主,其含量達(dá)到(11.262±0.23)mg/mL,其次為抗壞血酸、乳酸、草酸、L-酒石酸和醋酸。酵素中有機(jī)酸主要源自植物材料中酸性物質(zhì)溶出以及微生物大量繁殖而生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物[29]。目前,從食用植物酵素自然發(fā)酵過(guò)程中分離得到的優(yōu)勢(shì)菌種主要為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等產(chǎn)酸微生物[30]。酵母菌通過(guò)糖降解途徑和三羧酸循環(huán),在生長(zhǎng)期可產(chǎn)生大量有機(jī)酸[34];L-蘋果酸是三羧酸代謝循環(huán)的中間物質(zhì)[35];醋酸菌在糖源充足的情況下可直接利用葡萄糖生成醋酸,或?qū)⒔湍妇x產(chǎn)生的乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸[1-2];乳酸菌通過(guò)糖代謝生成乳酸,在厭氧條件下還可將乳酸氧化轉(zhuǎn)化為醋酸[36]。張夢(mèng)梅等[36]對(duì)4種市售酵素進(jìn)行有機(jī)酸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同原料的酵素中有機(jī)酸的組成和含量差異較大,主要有機(jī)酸為乳酸、醋酸、草酸和蘋果酸,與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。馬曉娟等[37]用植物乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜原漿,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸的含量逐漸增加,蘋果酸的含量逐漸減低。樊秋元等[31]研究發(fā)現(xiàn)黑加侖酵素中有機(jī)酸以檸檬酸、蘋果酸、草酸和奎寧酸為主,含量分別為1.567、0.220、0.110、0.093 mg/mL。

2.5 游離氨基酸種類及含量測(cè)定

圖5為游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵60 d時(shí)沙棘酵素樣品游離氨基酸HPLC色譜圖。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的游離氨基酸HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of free amino acids standard and sample

從圖中可知,沙棘酵素中含有16種游離氨基酸,未檢測(cè)到纈氨酸。沙棘酵素的游離氨基酸含量見表4。

表4 沙棘酵素的游離氨基酸含量Table 4 Contents of free amino acid in sea-buckthorn Jiaosu

由表4可見,發(fā)酵60 d的沙棘酵素總游離氨基酸含量為(3.380±0.03)mg/mL,主要為谷氨酸,含量為(1.257±0.05)mg/mL;其次為丙氨酸、天冬氨酸、組氨酸、脯氨酸和絲氨酸,占總游離氨基酸含量的49.47%,其余游離氨基酸的含量較低。高熳熳等[38]以總抗氧化能力為指標(biāo)優(yōu)化糙米酵素制備工藝,最優(yōu)發(fā)酵條件下糙米酵素的總游離氨基酸含量可達(dá)7.139 mg/mL。沙棘酵素中可能存在的乳桿菌具有較強(qiáng)酸性內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶、寡肽酶活力,能將植物材料中的、胨和多肽分解為氨基酸,同時(shí),發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物及衰亡后細(xì)胞自溶也是游離氨基酸的重要來(lái)源[32]。

2.6 沙棘酵素的體外抗氧化性能

2.6.1 沙棘酵素的超氧自由基清除能力

沙棘酵素的超氧自由基清除能力見圖8。

圖8 沙棘酵素的超氧自由基清除能力Fig.8 Superoxide radical scavenging ability of sea-buckthorn Jiaosu

由圖8可知,沙棘酵素的超氧自由基能力表現(xiàn)出較好的濃度依賴性,隨著加入量的增加,近似梯度增加。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),沙棘酵素的超氧自由基清除能力從25.86%增至80.79%,但均低于VC對(duì)照。經(jīng)計(jì)算,沙棘酵素的IC50為4.049 mg VC/mL。蔣增良等[3]研究表明葡萄酵素對(duì)超氧自由基的清除能力表現(xiàn)出較好的濃度依賴性,在 5 μL~25 μL 范圍,從 8.73%增加到了44.28%,IC50為7.35 mg VC/mL。

2.6.2 沙棘酵素的羥基自由基清除率

沙棘酵素的羥基自由基清除能力見圖9。

圖9 沙棘酵素的羥基自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging ability of sea-buckthorn Jiaosu

由圖9可知,沙棘酵素對(duì)羥基自由基清除率也具有濃度依賴性特點(diǎn),在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),從45.88%增至 98.55%。當(dāng)樣品加入量在 60 μL~240 μL 之間時(shí),沙棘酵素對(duì)羥基自由基清除率遠(yuǎn)高于VC對(duì)照,而樣品加入量大于300 μL時(shí),則略低于VC對(duì)照。經(jīng)計(jì)算,沙棘酵素的IC50為2.554 mg VC/mL。程勇杰等[8]研究表明發(fā)酵150 d的柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對(duì)羥基自由基清除率的IC50分別為2.846、7.614、4.726 mg VC/mL。沙棘酵素較強(qiáng)的羥基自由基清除能力可能是由于酵素中有機(jī)酸、多糖等物質(zhì)綜合作用的結(jié)果,包永春等[39]通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)乳酸、蘋果酸和酒石酸均具有清除羥基自由基的能力;研究表明酵母壁上的多糖具有一定的羥基自由基清除能力[22]。

2.6.3 沙棘酵素的DPPH自由基清除能力

沙棘酵素的DPPH自由基清除能力見圖10。

圖10 沙棘酵素的DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH radical scavenging ability of sea-buckthorn Jiaosu

從圖10可見,沙棘酵素具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),明顯高于VC對(duì)照。DPPH自由基清除能力增長(zhǎng)趨勢(shì)與超氧自由基清除能力類似,具有濃度依賴性,樣品加入量在6 μL~36 μL之間時(shí),從48.41%增至95.35%。經(jīng)計(jì)算,沙棘酵素的IC50為0.406 mg VC/mL。程勇杰等[6]研究發(fā)現(xiàn)樹莓酵素和藍(lán)莓酵素對(duì)DPPH自由基清除能力在3 μL~15 μL范圍,從23.72%增加到了66.03%,IC50分別為2.00、8.70mgVC/mL。沙棘酵素較好的DPPH自由基清除能力可能是酵素中有機(jī)酸、游離氨基酸等協(xié)同作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,沙棘酵素在0~60 d的發(fā)酵過(guò)程中,體外抗氧化性能、總酸、總游離氨基酸和總黃酮含量總體均呈上升趨勢(shì),且總酸含量和總游離氨基酸含量與3個(gè)體外抗氧化性能指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。發(fā)酵60 d沙棘酵素的超氧自由基清除能力、羥基自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均表現(xiàn)出濃度依賴性,IC50分別為 4.049 、2.554、0.406 mgVC/mL。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),羥基自由基清除能力和DPPH自由基清除能力優(yōu)于VC對(duì)照,說(shuō)明沙棘酵素具有一定的體外抗氧化性能。張浩然等[23]研究發(fā)現(xiàn)沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中,總酚與總酸含量、抗氧化性能呈先上升再動(dòng)平衡的變化,總酚、總酸和琥珀酸與抗氧化性能指標(biāo)之間具有極顯著的正相關(guān)性(p<0.01),并認(rèn)為沙棘酵素所含的酚類物質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)具有抗氧化作用;潘梓源等[40]研究表明桂圓酵素中至少含有20余種酚類化合物,除了綠原酸等4種酚類化合物外,其他均由微生物代謝產(chǎn)生。因此,除進(jìn)一步延長(zhǎng)沙棘酵素發(fā)酵時(shí)間考察其抗氧化性能變化外,有必要對(duì)其發(fā)酵過(guò)程的酚類、有機(jī)酸及游離氨基酸的組成進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析,并研究其聯(lián)合抗氧化作用。發(fā)酵60 d沙棘酵素主要有機(jī)酸為L(zhǎng)-蘋果酸,還含有抗壞血酸、乳酸、草酸、L-酒石酸和醋酸。張浩然等[23]研究發(fā)現(xiàn)沙棘酵素0~120 d發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸以酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸為主,與本研究結(jié)果類似。發(fā)酵60 d沙棘酵素主要游離氨基酸為谷氨酸,其次為丙氨酸、天冬氨酸、組氨酸、脯氨酸和絲氨酸。陳小偉等[41]利用氨基酸分析儀對(duì)草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸變化進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)155 d的發(fā)酵,草莓酵素中蛋白質(zhì)和氨基酸含量有所提高,其中氨基酸含量最高的是天冬氨酸和谷氨酸。目前,食用植物酵素的生產(chǎn)大部分仍采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝,發(fā)酵過(guò)程涉及到多種微生物不同的代謝過(guò)程,發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸、游離氨基酸種類及含量的變化與微生物群落結(jié)構(gòu)的演替有關(guān),因此有必要開展對(duì)沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程微生物整體群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律的研究,明確對(duì)其抗氧化性能變化起關(guān)鍵作用的核心菌群,為沙棘酵素發(fā)酵階段的監(jiān)測(cè)及調(diào)控方法提供理論基礎(chǔ)。

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