馬蕓蕓 李 禮 趙 琳

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科，銀川 750001）

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用[1-2]。在毒性作用試驗中，阿霉素具有顯著的心肌毒性，可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的心肌損傷，最終發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病或充血性心力衰竭[3-4]。miRNA-214是近年來發(fā)現(xiàn)的一類對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用的微小RNA，在心肌細(xì)胞的相關(guān)研究中，miRNA-214的表達(dá)同樣豐富[5-6]。但目前關(guān)于miRNA-214對阿霉素心肌損傷的相關(guān)研究較少。因此，本研究探討miRNA-214對阿霉素相關(guān)心肌損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床提供新的靶向治療方向。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

6～8周SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量（240±20） g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，動物合格證號：0001517。鈣網(wǎng)蛋白抗體購于上海順博生物工程有限公司；熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒均購于武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 攜帶miRNA-214的腺相關(guān)病毒構(gòu)建

構(gòu)建中間載體質(zhì)粒pGenesil-12-pre-miRNA-214，限制性酶切位點后的片段中包含miRNA-214和miR-miRNA-214，構(gòu)建腺相關(guān)病毒質(zhì)粒 pAAV-premiRNA-214，將質(zhì)粒導(dǎo)入AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生含目的基因miRNA-214的腺相關(guān)病毒。

1.3 模型構(gòu)建及分組

將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、miRNA-214轉(zhuǎn)染組，分別采用不同的處理方法。對照組：正常飼養(yǎng)，不采取任何處理。模型組：采用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)麻醉，將10 mg阿霉素溶解于30 mL生理鹽水中，根據(jù)1.8 mg/kg劑量標(biāo)準(zhǔn)，隔日尾靜脈注射阿霉素，總計給藥10次，建立阿霉素心肌損傷模型。 miRNA-214轉(zhuǎn)染組：麻醉后氣管插管，連接小型動物呼吸機(jī)，造模過程同模型組。向大鼠尾靜脈注射0.1 mL miRNA-214-AAV。

1.4 超聲心動圖檢測

大鼠麻醉后，固定，備皮，采用彩色多普勒超聲儀對大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，指標(biāo)包括左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventriular end-systolic diameter，LVSD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventriular end-diastolic diameter， LVDD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒張末期室間隔厚度（interventricular septal thickness， IVST）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 心質(zhì)量及心肌肥厚指數(shù)測定

各組大鼠稱質(zhì)量，麻醉后，取出心置于生理鹽水中，沖洗干凈，用雙側(cè)濾紙吸干水分，用電子天平稱量全心質(zhì)量、左心室和右心室質(zhì)量。全心肥厚指數(shù)=全心質(zhì)量/體質(zhì)量；左心室心肌肥厚指數(shù)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量；右心室心肌肥厚指數(shù)=右心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 炎癥因子及心功能標(biāo)志物檢測

收集各組大鼠靜脈血，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠炎癥因子谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平及心功能標(biāo)志物肌酸激酶（creatine kinase, CK）、B型利鈉肽（B type natriuretic peptide, BNP）水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 心組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

切取各組大鼠左心室前壁危險區(qū)心肌組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋后切片，進(jìn)行H-E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)改變并采集圖像。

1.8 PCR檢測心肌組織miRNA-214表達(dá)水平

參照操作說明書提取總RNA，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后擴(kuò)增成DNA。miRNA-214正向引物序列為5'-ACAGCAGGCAC AGAC-3'；反向引物序列為5'-GAGCAGGCTGGAG AA-3'；miRNA-214探 針 引 物 序 列 為5'-FAM+AGG CAGTGCGCGTG-MGB-3'；選取U6作為內(nèi)參基因。定量實時PCR檢測為一式3份進(jìn)行，包括無模板對照，將miRNA-214的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為U6。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃變性30 s，50℃退火30 s，40個循環(huán)，最后70℃延伸10 min結(jié)束。實時PCR實驗的平均水平使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行微小修正。閾值循環(huán)（Ct）定義為熒光通過固定閾值的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)。計算miRNA-214和U6的平 均Ct，將ΔCt確 定 為miRNA-214的 一 式3份Ct的 平 均 值 減 去U6的 一 式3份Ct的 平 均 值，與U6相比，樣品的miRNA-214的相對拷貝數(shù)表示為2-ΔΔCt。

1.9 免疫印跡檢測心肌組織鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)水平

收集各組的大鼠心肌組織，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。混合上樣緩沖液，煮沸變性，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉鈣網(wǎng)蛋白一抗（工作濃度1∶500）二抗（工作濃度1∶2 500）孵育、ECL法顯影定影。通過Quantity One軟件分析條帶強(qiáng)度，以U6為內(nèi)參，檢測鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用x±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量

對照組大鼠一般狀況良好，進(jìn)食飲水正常，無死亡情況發(fā)生。模型組大鼠在第4天時，出現(xiàn)明顯的精神不佳，進(jìn)食及活動減少，毛發(fā)無光澤；miRNA-214轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)不良癥狀的時間較模型組晚，進(jìn)食量及飲水量略高于模型組。對照組大鼠體質(zhì)量一直呈顯著的上升趨勢，模型組與miRNA-214轉(zhuǎn)染組大鼠體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢，但miRNA-214轉(zhuǎn)染組大鼠體質(zhì)量下降更為緩慢（圖1）。

2.2 各組大鼠心質(zhì)量及肥厚指數(shù)比較

第21天處死大鼠，完整取出心及肝。3組大鼠的全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量、全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與對照組比較，模型組及miRNA-214轉(zhuǎn)染組全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量顯著降低，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，miRNA-214轉(zhuǎn)染組全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量顯著升高，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠心質(zhì)量及肥厚指數(shù)比較（n=10， ±s）Tab 1 Comparison of cardiac mass and hypertrophy index of rats in each group（n=10， ±s）

表1 各組大鼠心質(zhì)量及肥厚指數(shù)比較（n=10， ±s）Tab 1 Comparison of cardiac mass and hypertrophy index of rats in each group（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

2.3 各組大鼠心組織病理改變比較

對照組心肌組織結(jié)構(gòu)未明顯異常，肌纖維完整，橫紋排列整齊，肌漿內(nèi)無空泡變性。與對照組比較，模型組心肌纖維排列紊亂，邊界不規(guī)則，心肌纖維斷裂，細(xì)胞水腫，胞質(zhì)染色變淺，局部有炎細(xì)胞浸潤。 miRNA-214 轉(zhuǎn)染組心肌纖維破壞程度較模型組顯著減輕，肌纖維完整，橫紋排列整齊，有少許中性粒細(xì)胞浸潤，無空泡變性（圖2）。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞miRNA-214表達(dá)水平比較

與對照組大鼠相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞中miRNA-214的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，轉(zhuǎn)染組大鼠心肌細(xì)胞中miRNA-214相對表達(dá)量顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5 各組大鼠炎癥因子及心功能指標(biāo)比較

3組大鼠的心功能相關(guān)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。兩兩比較后顯示，模型組的ALT、AST、LDH、CK、BNP水平最高，miRNA-214轉(zhuǎn)染組次之，對照組相關(guān)指標(biāo)均最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 3組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 2 Comparison of heart function indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

表2 3組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 2 Comparison of heart function indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

2.6 各組大鼠心結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

3組 大 鼠 的LVSD、LVDD、LVFS、LVPWT、LVEF比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與對照組比較，模型組及miRNA-214轉(zhuǎn)染組LVSD、LVDD顯著升高，LVFS、LVEF顯著降低；與模型組比較，miRNA-214轉(zhuǎn)染組LVSD、LVDD顯著降低，LVFS、LVEF顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 3組大鼠心結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 3 Comparison of heart structure indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

表3 3組大鼠心結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 3 Comparison of heart structure indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

圖1 3組大鼠體質(zhì)量變化.圖2 3組大鼠心肌組織病理改變，標(biāo)尺=100 μm。A：對照組；B：模型組；C：miRNA-214轉(zhuǎn)染組.圖3 3組大鼠心肌細(xì)胞miRNA-214表達(dá)情況。*P＜ 0.05 vs 對照組；△P＜0.05 vs 模型組.Fig 1 Changes in body mass of three groups of rats.Fig 2 H-E staining diagram of myocardial cells in three groups of rats， bar=100 μm. A：Control group；B：Model group；C：miRNA-214 transfection group.Fig 3 Expression of miRNA-214 in myocardial cells of three groups of rats. *P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model.

2.7 各組大鼠心肌細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)比較

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組鈣網(wǎng)蛋白相對表達(dá)量升高；與模型組相比，轉(zhuǎn)染組鈣網(wǎng)蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 3組大鼠心肌細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)水平Fig 4 Expression level of calreticulin in cardiomyocytes of three groups of rats

3 討論

腫瘤化療藥物阿霉素具有明顯的心肌毒性并可引起心力衰竭，在不削弱其化療作用的前提下減輕其心肌毒性是臨床熱點的研究方向[7]。Gupta等[8]報道在阿霉素誘導(dǎo)的心臟模型中，RNA結(jié)合蛋白QKI表達(dá)下降，確認(rèn)OKI提高了心肌細(xì)胞對阿霉素的敏感性，而過表達(dá)QKI則抑制了阿霉素誘導(dǎo)的心肌凋亡，并證實是通過調(diào)控circRNA的表達(dá)發(fā)揮作用。

本研究對大鼠一般狀況及體質(zhì)量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示對照組大鼠一般狀況良好，進(jìn)食飲水正常，無死亡情況發(fā)生。相較于模型組，miRNA-214轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出可有效緩解其不良狀態(tài)，并且出現(xiàn)不良癥狀的時間較模型組晚，進(jìn)食量及飲水量略高于模型組。實時PCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-214轉(zhuǎn)染組miRNA-214的表達(dá)水平比對照組僅模型組大鼠明顯升高。本研究成功使得miRNA-214在小鼠心中過表達(dá)，過表達(dá)能夠誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚，并導(dǎo)致心功能受損，這與已有研究結(jié)果一致[9-10]。另外，miRNA-214的過度表達(dá)可逆轉(zhuǎn)缺陷心室肌細(xì)胞的增殖低下，大鼠miRNA-214的靶向缺失會出現(xiàn)異常的心形態(tài)。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)心肌損傷狀況后，心肌細(xì)胞增殖受阻，可能會影響其他miRNA的表達(dá)， 從而出現(xiàn)某類型miRNA表達(dá)量下降；從另一個角度來說，如果刺激相應(yīng)類型miRNA的過表達(dá)，可能會在一定程度上抑制心肌細(xì)胞的增殖[11]。另一方面，本研究通過腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建心肌細(xì)胞高表達(dá)miRNA-214的大鼠模型。通過超聲心動圖檢查顯示，模型組大鼠的LVSD、LVDD顯著高于對照組及轉(zhuǎn)染組，LVFS、LVEF明顯較低，提示大鼠以左心室結(jié)構(gòu)擴(kuò)張、收縮功能下降為主，表明模型構(gòu)建初步成功。同時，對大鼠心進(jìn)行稱重后顯示，模型組的全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量最低，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)最高，miRNA-214轉(zhuǎn)染組次之。出現(xiàn)上述結(jié)果可能歸因于miRNA-214以組織特異性方式表達(dá)，并在組織發(fā)育和許多生物過程中起關(guān)鍵作用。miRNA負(fù)責(zé)細(xì)胞表觀基因組的改變，能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。最近研究表明，miRNA和其他表觀遺傳因子可以相互調(diào)節(jié)或協(xié)同調(diào)節(jié)幾種生物過程[12]。許多實驗研究已經(jīng)證明鈣網(wǎng)蛋白可以調(diào)節(jié)多種類型細(xì)胞或疾病狀態(tài)中的miRNA表達(dá)[13]，另一方面，miRNA可以直接靶向表觀遺傳因子，例如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或鈣網(wǎng)蛋白，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并有效調(diào)控miRNA與其他表觀遺傳機(jī)制之間的協(xié)調(diào)行動，以加強(qiáng)miRNA-214基因表達(dá)[14]。

鈣網(wǎng)蛋白是一種進(jìn)化上高度保守的多功能蛋白質(zhì)，蛋白在腫瘤細(xì)胞，凋亡的細(xì)胞，一些藥物處理的細(xì)胞（如蒽環(huán)類藥物）的表面表達(dá)量要多于正常的細(xì)胞[15]。研究者通過在體實驗發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可增加大鼠心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，且其表達(dá)量與梗死面積呈負(fù)相關(guān)[16]。王建禮[17]發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白后處理減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞死亡、LDH漏出和氧化應(yīng)激程度。本研究免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)量升高；與模型組相比較，轉(zhuǎn)染組中鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達(dá)量顯著減低，表明miRNA-214的過表達(dá)下調(diào)了鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，這可能是miRNA-214發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一，后續(xù)工作將探討其生物學(xué)功能及其在心肌損傷保護(hù)中的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miRNA-214可通過下調(diào)鈣網(wǎng)蛋白，緩解心肌損傷，有望成為一個新的治療靶標(biāo)。