邵健豐，鄒桂花，翟國偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 公共實驗室，浙江 杭州 310021)

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]是禾本科一年生草本植物，屬于經(jīng)濟作物。按照用途和性狀，高粱可分為食用高粱、飼草高粱、糖用高粱、帚用高粱等。其中，帚用高粱除了有一定的高粱籽產(chǎn)量外，穗子制成笤帚或炊帚是其最重要的經(jīng)濟價值。高粱笤帚和炊帚目前在農(nóng)村依然常見，而隨著人們越來越追求環(huán)保和原生態(tài)，這種古老的“家具”也開始在網(wǎng)上售賣，據(jù)作者在某網(wǎng)絡(luò)平臺搜索，銷售高粱炊帚的店鋪有270余家，銷售高粱掃把的店鋪更是有1 300余家。本文以一個已經(jīng)公布全基因組序列的籽粒高粱品種和一個帚用高粱品種為親本構(gòu)建的F2群體為研究材料，構(gòu)建了帚高粱的遺傳連鎖圖譜。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究實驗材料為F2群體，母本為籽粒高粱Btx623，植株較矮、穗型緊湊，為已經(jīng)公布全基因組序列的測序品種。父本為帚高粱MN-2710，植株較高、穗型較散。兩親本雜交后獲得F1，經(jīng)過自交后得到F2群體。

1.2 高粱總DNA的提取

高粱總DNA的提取采用略加簡化的CTAB法[1]。取高粱孕穗期較嫩葉片約100 mg放入2.0 mL離心管，加入液氮用一次性筷子快速研磨成粉末，加入750 μL在65 ℃水浴預(yù)熱過的CTAB提取液，65 ℃ 溫浴60 min，期間每15 min上下顛倒混勻幾次；加入750 μL體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇混合液，顛倒混勻后，4 ℃，14 000g離心10 min；吸取600 μL上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 mL離心管，加入600 μL預(yù)冷的異丙醇，混勻后于-20 ℃冰箱冷凍過夜；14 000g離心10 min，倒掉混合液后加入1 mL 70%乙醇顛倒數(shù)次清洗，14 000g離心沉淀，倒掉乙醇并室溫晾干，然后用500 μL滅菌水溶解DNA，備用。

1.3 SSR標記的開發(fā)

根據(jù)已公布的高粱基因組序列，本研究室自主開發(fā)了1 033個SSR標記，從中篩選出覆蓋高粱10條染色體的366個在雙親中有多態(tài)性的標記，用于鑒定F2群體的基因型。

1.4 PCR擴增

PCR總反應(yīng)體積為15 μL，包括7.5 μL 2×Super PCR Mix(北京擎科生物技術(shù)有限公司)，2 μL模板DNA (10 ng·μL-1)，5.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；15 ℃保存。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5 數(shù)據(jù)處理與遺傳圖譜構(gòu)建

根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，與母本一致的帶型記為a，與父本一致的帶型記為b，雜合帶型記為h，異常帶型或缺失均記為·。所得基因型數(shù)據(jù)用JoinMap 4.0軟件分析標記間的連鎖關(guān)系并計算遺傳距離(cM)，根據(jù)遺傳距離繪制遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記檢測

利用本研究室自行開發(fā)的1 033個SSR標記對親本Btx623和MN-2710進行了多態(tài)性檢測，其中有366個在雙親間表現(xiàn)出多態(tài)，多態(tài)率為35.4%。用這366個標記檢測F2群體的190個單株并用于構(gòu)建分子標記遺傳圖譜。結(jié)果表明，條帶清晰的標記244個，利用這244個標記檢測190個單株，合計檢測位點46 360個，其中母本帶型10 873個，父本帶型11 198個，雜合帶型22 708個，因條帶模糊或缺失無法讀取的1 581個。

2.2 遺傳圖譜

遺傳圖譜上分子標記的分布情況如表1和圖1所示。連鎖群命名參考Kim等[2]命名方法。遺傳連鎖圖總共包含12個連鎖群(Lg.1-Lg.12)(圖1)，連鎖群上的標記數(shù)量從5(Lg.3)到35(Lg.11)不等。圖譜總長度為1 164 cM，包含243個標記，標記平均間距4.79 cM。連鎖群最長的為124.5 cM(Lg.7)，最短的為41.4 cM(Lg.2)。在Lg.3、Lg.5、Lg.7、Lg.9上分別有一個超過25 cM的間隙。具體各連鎖群的長度、標記數(shù)目、標記平均間距見表1。

表1 分子標記在連鎖群上的分布

左側(cè)為分子標記在連鎖圖上的遺傳位置(cM)，右側(cè)為標記名稱。

3 討論

1990年，美國的Hulbert發(fā)表了世界上第一張高粱的分子遺傳連鎖圖，該連鎖圖包含37個來源于玉米的RFLP標記，總長度為283 cM[3]。隨后，高粱分子作圖得到快速發(fā)展。本研究室就曾經(jīng)以定位甜高粱莖稈汁液含糖量及其相關(guān)性狀的QTL為目的構(gòu)建了甜高粱的分子遺傳連鎖圖[4]。本研究通過一個籽粒高粱品種和一個帚高粱品種雜交所得的F2群體構(gòu)建了一張總長度為1 164 cM的遺傳連鎖圖，包含243個SSR標記，標記平均間距為4.79 cM。從圖1可以看出，在Lg.3、Lg.5、Lg.7、LG.9連鎖群上分別還有比較大的間隙，而且Chr.1和Chr.2兩條染色體還分別分成了2個部分，在這些間隙開發(fā)更多標記可能能夠彌補這些缺陷。另外，Lg.4、Lg.9、Lg.10連鎖群成簇分布現(xiàn)象也比較嚴重。

構(gòu)建分子遺傳連鎖圖只是本研究的開始，結(jié)合之前對該F2群體田間考察所得穗柄長、穗枝梗長等表型數(shù)據(jù)[5]，希望可以定位到穗型相關(guān)基因的QTL位點，為精細定位相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。