吳會琴，王 娜，黃夢迪，劉蓓蓓，楊 璞，高小麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

糜子(PanicummiliaceumL.)是禾本科最古老的1a生草本作物之一[1]。因其生育期短，抗旱能力強，是中國重要的搶險救災(zāi)作物，并被廣泛用作儲備作物和動物飼料[2]。糜子主要分布在中國的陜西、山西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙等干旱半干旱地區(qū)[3]，是當(dāng)?shù)刂匾募Z食作物和經(jīng)濟作物。糜子富含蛋白質(zhì)和礦質(zhì)營養(yǎng)元素，是現(xiàn)代健康功能食品開發(fā)的重要資源[4]。但因品種和生態(tài)環(huán)境等因素的限制，糜子的產(chǎn)量相對較低，在一定程度上限制了糜子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，所以，提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)已然是糜子育種工作的重要目標(biāo)[5]。

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過組織培養(yǎng)和基因工程等手段定向改良品種已成為作物研究的一個重要方向，而通過生物技術(shù)途徑進行遺傳改良的首要環(huán)節(jié)就是建立穩(wěn)定高效的離體培養(yǎng)體系。目前，已經(jīng)有很多關(guān)于小麥[6]、玉米[7]、水稻[8]、高粱[9]等禾谷類作物再生體系建立的報道，其中，幼胚為應(yīng)用較多且較為理想的外植體之一，并且通過幼胚誘導(dǎo)愈傷組織并獲得再生植株，從而進行遺傳轉(zhuǎn)化等相關(guān)工作。但目前有關(guān)糜子再生技術(shù)體系的研究仍處于探索階段，尚不能滿足種質(zhì)改良和遺傳育種工作的需求。因此，本試驗以‘陜糜1號’和‘陜糜2號’2種糜子的幼胚作為外植體材料，旨在通過篩選適宜糜子幼胚誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基及激素，建立并優(yōu)化糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系，以期為糜子高效育種和遺傳改良等研究奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以糯性糜子品種‘陜糜1號’和粳性糜子品種‘陜糜2號’為試驗材料，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小雜糧課題組提供。

1.2 試驗所用培養(yǎng)基

如表1所示，2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、KT(激動素，Kinetin)，所有培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH均為5.8，121 ℃高溫高壓滅菌20 min， 備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體的培養(yǎng) 糜子開花后8～10 d，于每天9：00-10：00，剪下穗子，插入自來水中，用冰盒帶回。置于4 ℃冰箱內(nèi)對穗子進行低溫預(yù)處理培養(yǎng)，處理時間分別為1(CK)、2、3、4、5、6、7 d，接種前將穗子在自來水下沖洗10 min，然后在超凈工作臺中用體積分數(shù)為75%的乙醇和質(zhì)量分數(shù)為20%的次氯酸鈉溶液分別消毒2 min、15 min，然后用無菌水沖洗3次，將穗子置于無菌濾紙上吸干水分，備用。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基種類Table 1 Types of induction medium

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 在超凈工作臺中用鑷子剝?nèi)ニ胱油鈿?，將里面的白色半透明幼胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個三角瓶中接種20粒幼胚。 (27±1) ℃黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，期間注意觀察，及時清理污染樣品。14 d后繼代1次，21 d后統(tǒng)計糜子幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率。各試驗處理重復(fù)3次。

1.3.3 愈傷組織的分化 將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，每個三角瓶接種5塊愈傷組織。分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤，6-Benzylaminopurine)和不同質(zhì)量濃度的NAA(萘乙酸，1-Naphthaleneacetic acid)(0、0.1、0.5 mg/L)，在(30±1) ℃下16 h/8 h(亮/暗)散光培養(yǎng)。21 d后統(tǒng)計綠點率和出芽率(芽長1 cm視為出芽，小于1 cm視為出現(xiàn)綠點)，每2周更換1次培養(yǎng)基。

1.3.4 生根培養(yǎng)及煉苗移栽 待到幼苗長到3 cm左右的時候，將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA(0.1 mg/L)，(27±1) ℃黑暗培養(yǎng)14 d后打開三角瓶口，煉苗2～3 d后將其移入盛有基質(zhì)的花盆里。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行處理和比較分析。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%

綠點率=(產(chǎn)生綠點的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù))×100%

出芽率=(產(chǎn)生芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫預(yù)處理時間對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖1可知，適當(dāng)?shù)? ℃低溫預(yù)處理有助于糜子幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)過3 d低溫預(yù)處理，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率均達到最高，分別為60.38%、56.61%。第4天，糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率開始下降，但與低溫預(yù)處理2 d相比，其仍然有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率。隨著處理時間的增加，幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率繼續(xù)呈下降趨勢。低溫預(yù)處理6 d后，‘陜糜1號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率顯著低于對照；‘陜糜2號’與對照無明顯差異。綜上結(jié)果，低溫預(yù)處理 3 d對提高糜子的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率有積極 作用。

2.2 不同質(zhì)量濃度2,4-D對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物的快速繁殖有著至關(guān)重要的作用，不僅影響植物細胞自身的全能性表達，還可以通過與內(nèi)源激素的相互作用影響細胞的分裂和分化[10]。

不同字母表示不同處理間差異顯著性(P<0.05)，下同

添加2,4-D對‘陜糜1號’‘陜糜2號’幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織有重要意義(圖2)。在MS和N6 2種基本培養(yǎng)基，分別單獨添加不同質(zhì)量濃度的2,4-D，糜子幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著不同?？傮w而言，隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加，‘陜糜1號’、‘陜糜2號’幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，而且2種糜子幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率為20.00%～65.85%。并且二者的愈傷組織誘導(dǎo)率，均在2,4-D 質(zhì)量濃度為3 mg/L時達到最大，分別為65.85%(‘陜糜1號’)、 59.16%(‘陜糜2號’)，且與其他處理存在顯著 差異。

‘陜糜1號’和‘陜糜2號’均在M3培養(yǎng)基顯示出最高的愈傷組織誘導(dǎo)率。同時，僅在M3培養(yǎng)基中，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的出愈率均達到50%以上，但在M2培養(yǎng)基中，2個糜子品種的幼胚也存在較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，甚至高于N3培養(yǎng)基。由此可見，MS培養(yǎng)基比N6培養(yǎng)基更適合‘陜糜1號’和‘陜糜2號’進行幼胚愈傷組織誘導(dǎo)。因此，可以選擇M3培養(yǎng)基做‘陜糜1號’和‘陜糜2號’幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

圖2 不同2,4-D濃度下的糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率Fig.2 Frequency of callus induction from immature embryo of proso millet under different 2,4-D concentration

2.3 不同質(zhì)量濃度2,4-D和KT對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.1 對‘陜糜1號’的影響 在植物再生體系建立中，將低質(zhì)量濃度的KT配合較高質(zhì)量濃度的2,4-D使用，是誘導(dǎo)愈傷組織的常見方法之一[11]。圖3為‘陜糜1號’的幼胚在2,4-D與KT組合的培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)情況。比較發(fā)現(xiàn)，在不添加KT的情況下，隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且IM5培養(yǎng)基中，‘陜糜1號’的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為65.85%；添加了KT后，愈傷組織的質(zhì)量明顯得到改善，在IM7培養(yǎng)基中，‘陜糜1號’的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率與其他添加了KT的愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，IM9、IM10、 IM11、 IM12、IM21、 IM22、 IM23和IM24培養(yǎng)基中，幼胚的愈傷組織容易發(fā)生褐化，也有少量會出現(xiàn)水漬狀愈傷組織，同時期其他培養(yǎng)基中并未出現(xiàn)此種情況，說明2,4-D質(zhì)量濃度過高易導(dǎo)致‘陜糜1號’幼胚愈傷組織褐化。在IM7培養(yǎng)基中，得到的愈傷組織質(zhì)量最佳，塊大，致密，顏色淡黃或者白色。因此，2,4-D和KT的組合中，IM7培養(yǎng)基較適合‘陜糜1號’的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)。

圖3 不同質(zhì)量濃度2,4-D和KT下的‘陜糜1號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率Fig.3 Frequency of callus induction from immature embryo of Shaanmi No.1 under different concentrations of 2,4-D and KT

2.3.2 對‘陜糜2號’的影響 基因型對幼胚誘導(dǎo)愈傷組織有很大影響[12]。如圖4所示，在IM13、 IM14、 IM15、 IM16、 IM17、 IM18、 IM19、 IM20、 IM21、 IM22、 IM23和IM24培養(yǎng)基中，‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率在IM16、IM20、IM24 3種培養(yǎng)基中均達到同2,4-D質(zhì)量濃度組合最高，分別為44.92%、43.59%、47.68%，且與其他組合存在顯著差異，說明在N6培養(yǎng)基中添加KT有利于促進幼胚誘導(dǎo)形成愈傷組織。而在MS培養(yǎng)基中，‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率達到最高時(59.27%)，KT的質(zhì)量濃度仍為0 mg/L。同時，在IM6培養(yǎng)基中得到了質(zhì)量較好的愈傷組織，這與‘陜糜1號’在MS培養(yǎng)基中的響應(yīng)存在一定差異，可能是由基因型的差異影響了愈傷組織誘導(dǎo)效率和產(chǎn)生的愈傷組織類型。因此，選擇IM6培養(yǎng)基為‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在IM16、IM20、IM24 3種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進一步深入研究N6培養(yǎng)基對‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的 影響。

圖4 不同質(zhì)量濃度2,4-D和KT下的‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率Fig.4 Frequency of callus induction from immature embryo of Shaanmi No.2 under different mass concentrations of 2,4-D and KT

2.4 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對糜子幼胚愈傷組織分化的影響

由表2可知，在1.0 mg/L 6-BA和不同質(zhì)量濃度NAA中，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的愈傷組織綠點率及出芽率不同。當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的綠點率均達到最高，分別為83.33%、88.33%，同時，其出芽率也達到最大值(36.67%、50.00%)。所以，本研究選擇MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA為適宜糜子幼胚愈傷組織分化的培養(yǎng)基。糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生過程見圖5。

表2 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA下的糜子幼胚愈傷組織綠點率及出芽率Table 2 Rate of green spot and bud induction from immature embryo calli of proso millet under different mass concentrations of 6-BA and NAA

a/A. 接種后14 d的幼胚愈傷組；b/B.繼代一次的愈傷組織；c/C.轉(zhuǎn)分化后14 d的幼胚愈傷組織；d/D.再生幼苗；f/F. 再生植株(a-f.‘陜糜1號’；A-F.‘陜糜2號’)

3 討 論

3.1 不同低溫預(yù)處理時間對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

低溫預(yù)處理可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率[13-14]。但是，對于低溫預(yù)處理的具體影響，學(xué)者們之間的看法不盡一致。有研究表明，低溫預(yù)處理可以顯著提高水稻花藥和成熟胚的出愈率和分化率[15-17]，而馮明芳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江粳稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率會降低，但分化率顯著提高；胡雪丹等[19]綜合比較， 低溫預(yù)處理2 d為葫蘆花藥愈傷誘導(dǎo)的最佳處理時間；周玉麗等[20]等的研究結(jié)果則是低溫預(yù)處理1 d，可以得到較高的甜葉菊愈傷組織率。本研究結(jié)果表明，低溫預(yù)處理3 d有利于糜子幼胚愈傷組織的形成。與前人研究結(jié)果不完全相同，可能是植物種類及所選外植體不同，使外植體在脫分化時對低溫處理的響應(yīng)不同所致。

3.2 不同質(zhì)量濃度2,4-D對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2,4-D作為一種常見的植物激素，對植物愈傷組織誘導(dǎo)有重要影響，且有學(xué)者研究表明，2,4-D是誘導(dǎo)形成愈傷組織的必要條件[21]。當(dāng)培養(yǎng)基中僅含有2,4-D時，外植體更容易產(chǎn)生愈傷組織，且2,4-D的最佳質(zhì)量濃度為2.0 mg/L[22]。王晶晶[23]研究發(fā)現(xiàn)，2,4-D質(zhì)量濃度為1.5～2.0 mg/L時，小麥幼胚的繼代培養(yǎng)效果最好，其中 2,4-D為2.0 mg/L時，甚至繼代5次后，再生率還高達29.8%。楊玉潔等[24]在對直立冬青幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)分化研究中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加0.5～2.0 mg/L 2,4-D時，對其幼胚誘導(dǎo)有積極作用，得到的幼胚誘導(dǎo)率最高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時，糜子幼胚誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量好且誘導(dǎo)率較高，這與徐鳳等[25]在節(jié)節(jié)麥的幼胚再生體系建立中的結(jié)論一致。本研究也表明，2,4-D質(zhì)量濃度過高或者過低，均會導(dǎo)致幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率的下降，且當(dāng)2,4-D達到較高的質(zhì)量濃度時，愈傷組織容易發(fā)生褐變，這與彭瓊等[26]的研究結(jié)果一致。

3.3 不同質(zhì)量濃度2,4-D和KT對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

國內(nèi)有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[23]，在小麥組織培養(yǎng)中，在誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L KT和2,4-D配合使用，將顯著提高小麥幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率。徐鳳等[25]在節(jié)節(jié)麥的幼胚體系建立中，發(fā)現(xiàn)KT對節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織分化有著顯著影響，且以KT濃度為1.0 mg/L時最佳。Asakura等[22]對番茄外植體再生能力進行比較，結(jié)果顯示，在MS培養(yǎng)基中添加2,4-D和KT，未成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率從42.4%到100%不等，其中，最適合番茄未成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合為2,4-D 2.0 mg/L和KT 5.0 mg/L。而別曉敏等[27]則認為適宜小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的的最佳激素組合為2,4-D 2.0 mg/L和ABA 0.3 mg/L。本試驗也選擇在2,4-D的基礎(chǔ)上，添加一定質(zhì)量濃度的KT，優(yōu)化糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)體系，研究結(jié)果證明，添加低質(zhì)量濃度的KT對愈傷組織的誘導(dǎo)率沒有顯著影響，但是可以明顯改善愈傷組織的質(zhì)量，這與李惠[11]的研究結(jié)果相同。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，‘陜糜2號’在N6+ 2,4-D+KT(1.5 mg/L)的組合中，即IM16、IM20、IM24培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，雖然低于僅含有2,4-D的培養(yǎng)基，但是，較之低質(zhì)量濃度的KT組合，愈傷組織誘導(dǎo)率已經(jīng)顯著提高，因不知持續(xù)增加KT的質(zhì)量濃度，出愈率變化的趨勢，所以暫時認定低質(zhì)量濃度的KT對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)影響不大，但尚不能確定高質(zhì)量濃度的KT對幼胚誘導(dǎo)率的影響，Asakura等[22]的研究結(jié)果在一定程度上為本研究的后續(xù)工作提供了依據(jù)。

3.4 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對糜子幼胚愈傷組織分化的影響

MS培養(yǎng)中添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA對植物愈傷組織分化有較大影響[28-29]。李揚等[30]認為適于野生一粒小麥的6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，且6-BA質(zhì)量濃度較高會使愈傷組織的褐化率升高，分化率降低，與本研究結(jié)果不盡一致，應(yīng)是由作物對激素的耐受力不同引起的。郭伶娜等[31]通過試驗得到，在只添加6-BA的培養(yǎng)基中，高羊茅的分化成苗率為33.1%，與本研究的結(jié)果相同。同時，他們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-BA和NAA配合使用時，可以促進愈傷組織分化成苗。本研究結(jié)果也顯示，在MS培養(yǎng)基中，當(dāng)6-BA的濃度為1.0 mg/L，NAA 的質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，糜子幼胚愈傷組織的綠點率和出芽率均為最高，體現(xiàn)了6-BA和NAA的組合對愈傷組織分化的積極作用，這可能是因為NAA的主要功能是誘導(dǎo)芽的生長和促進生根，可以有效地吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分[32]。

4 結(jié) 論

4 ℃低溫預(yù)處理3 d對糜子幼胚愈傷組織誘導(dǎo)最有利。在M3培養(yǎng)基中，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率均達到最大值；且在培養(yǎng)基中添加低濃度的KT可以明顯改善愈傷組織質(zhì)量，其中，2,4-D和KT的組合中，適宜‘陜糜1號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)是IM7培養(yǎng)基，適宜‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導(dǎo)是IM6培養(yǎng)基，存在基因型差異；適宜糜子幼胚愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA。