劉玲玲，馬海玉，劉武軍

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

中國綿羊資源豐富，大多數(shù)地方綿羊品種為單羔品種，只有少數(shù)綿羊?yàn)槎喔崞贩N[1]。產(chǎn)羔數(shù)是家畜關(guān)鍵和復(fù)雜的經(jīng)濟(jì)性狀，也是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[2]。產(chǎn)羔數(shù)為數(shù)量性狀，受多基因的控制，但產(chǎn)羔性狀的遺傳力較低，利用傳統(tǒng)選育方法獲得的遺傳進(jìn)展較慢，標(biāo)記輔助選擇能夠解決效率低下等問題，而尋找可靠的遺傳標(biāo)記則成為關(guān)鍵。

目前已經(jīng)確定能夠影響綿山羊產(chǎn)羔數(shù)的基因?yàn)锽MPR1B(Bone morphogenetic protein receptor1B)基因[3-4]，GDF9(Growth differentiation factor9)基因[5]，SLC5A1(Solute carrier family5member1)基因[6]，MTNR1A(Melatonin receptor1A)基因[7]。而排卵率和胚胎存活率也直接影響羊的產(chǎn)羔數(shù)[8]，研究報道，KIT(Tyrosine-protein kinase kit)和NGF(Nerve growth factor)基因能夠影響卵泡的生長[9-10]。NCOA1(Nuclear receptor coactivator1)基因?qū)ε咛サ拇婊钪陵P(guān)重要[11]，Xu等[12]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析研究高產(chǎn)綿羊與低產(chǎn)綿羊之間的差異，篩選出NCOA3(Nuclear receptor coactivator3)基因與Lcelandic綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。

KASP(Kompetitive allele specific polymerase chain reaction)技術(shù)是目前基因分型的一種重要手段。KASP主要是在廣泛的基因組DNA樣品中，對SNPs 和特定位點(diǎn)的InDels進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷，從而進(jìn)行基因分型。主要核心是利用2個通用熒光探針、2個通用淬滅探針，以及多個位點(diǎn)特異引物對SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測。相比于其他的檢測SNP方法，KASP技術(shù)擁有更高的通量、更快的速度、更低的成本及更準(zhǔn)確的結(jié)果[13-14]。Zhang等[15]利用KASP技術(shù)對造成荷斯坦牛遺傳缺陷的5個SNP及3個插入和缺失進(jìn)行分析。Kusza等[16]利用KASP技術(shù)對影響山羊產(chǎn)奶性狀的48個SNP進(jìn)行分析。

筆者前期對新疆不同產(chǎn)羔數(shù)綿羊的LAF-Seq測序數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析，篩選獲得可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的關(guān)鍵基因之一FSHR[17]。促卵泡激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)是GPCR(G protein-coupled receptors)家族的成員，這類受體具有3個受體蛋白鏈：胞外域、胞內(nèi)域和跨膜域[18-19]。FSHR轉(zhuǎn)導(dǎo)FSH信號的機(jī)制是：FSHR的胞外α-螺旋環(huán)和胞外域在細(xì)胞膜的表面偶聯(lián)FSH，F(xiàn)SHR被激活后通過胞內(nèi)域和跨膜域與G蛋白偶聯(lián)，最后完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。研究發(fā)現(xiàn)在豬FSHR基因的第10外顯子上，rs322800083和rs332115220構(gòu)成的單倍型C-T可以作為香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀輔助選育的分子標(biāo)記[21]；黔北麻羊FSHR基因的第1和第10外顯子突變對多羔性狀具有重要作用[22]。目前未見FSHR基因與阿勒泰羊、吐魯番黑羊、和田紅羊產(chǎn)羔數(shù)之間關(guān)系的報道。

本試驗(yàn)以阿勒泰羊、吐魯番黑羊、和田紅羊?yàn)檠芯繉ο?，基于NCBI中已有的FSHR基因的錯義突變位點(diǎn)(g.75132817C>T，g.75320579G>A，g.75320741G>A)，利用KASP技術(shù)對突變位點(diǎn)進(jìn)行分型，探究不同品種綿羊FSHR基因SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選影響不同品種高繁殖力的關(guān)鍵位點(diǎn)，為不同綿羊品種產(chǎn)羔數(shù)的選育提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

65只阿勒泰羊來自福海種羊場，240 只吐魯番黑羊來自新疆吐魯番市托克遜縣，111 只和田紅羊來自新疆和田地區(qū)皮山縣，均為經(jīng)產(chǎn)母羊 (2～3胎次)。

1.2 基因組DNA提取

綿羊血液樣本使用血液/組織DNA磁珠法提取試劑盒(志昂生物科技有限公司)對DNA進(jìn)行提取，DNA質(zhì)量利用 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 主要儀器設(shè)備

磁力架(Life Technologies DynaMagTM-2)，離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424)，Douglas Scientific NEXAR，Douglas Scientific Soellex，Douglas Scientific ARRAY，試劑盒(志昂生物科技有限公司)。

1.4 引物設(shè)計與合成

利用Prime 3軟件設(shè)計引物，由百邁客生物科技有限公司負(fù)責(zé)完成引物設(shè)計及合成。引物具體信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information of genes

1.5 PCR反應(yīng)程序

PCR反應(yīng)體系：2.5 μL的2×KASP Master Mix，0.07 μL引物，30～50 μg的DNA，總反應(yīng)體積為5 μL(ddH2O補(bǔ)足)。為避免對試驗(yàn)結(jié)果的錯誤判斷，因此設(shè)置空白對照(NTC)，其DNA模板用ddH2O代替。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性20 s，10個循環(huán)，61～55 ℃復(fù)性及延伸60 s(-0.6 ℃/循環(huán))，10個循環(huán)；95 ℃變性20 s，26個循環(huán)；最后55 ℃復(fù)性及延伸 60 s，26個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后利用帶FRET功能的酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取(數(shù)據(jù)讀取在40 ℃以下)。利用LGC_OMEGA軟件生成基因的分 型圖。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

利用KASP分型技術(shù)對位點(diǎn)分型成功后，計算每個位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)。利用SPSS 19.0中單因素方差分析和t檢驗(yàn)對平均產(chǎn)羔數(shù)和突變位點(diǎn)基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，產(chǎn)羔數(shù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個位點(diǎn)在3 個群體中的KASP分型結(jié)果

KASP分型技術(shù)是一種靈活的方法，其基因分型錯誤率為0.7%～1.6%[13]，利用此方法進(jìn)行FSHR基因的3個位點(diǎn)在阿勒泰羊、吐魯番黑羊、和田紅羊群體中的分型結(jié)果可靠。阿勒泰羊群體中，g.75132817C>T位點(diǎn)存在3種基因型：CC、CT、TT；g.75320579G>A位點(diǎn)存在2 種基因型：GG、GA、g.75320741G>A位點(diǎn)存在3種基因型：GG、GA、AA(圖1)。吐魯番黑羊群體中，g.75132817C>T位點(diǎn)存在3種基因型：CC、CT、TT；g.75320579G>A位點(diǎn)存在3種基因型：GG、GA、AA；g.75320741G>A位點(diǎn)存在3種基因型：GG、GA、AA(圖2)。和田紅羊群體中，g.75132817C>T位點(diǎn)存在3種基因型：CC、CT、TT；g.75320579G>A位點(diǎn)存在2種基因型：GG、GA；g.75320741G>A位點(diǎn)存在3種基因型：GG、GA、AA(圖3)。

2.2 3個群體FSHR基因不同位點(diǎn)的基因多態(tài)性分析

吐魯番黑羊群體中，3個位點(diǎn)均為野生型基因型頻率高于雜合型和突變型的基因型頻率，說明突變的個體數(shù)較少，突變頻率比較低；阿勒泰羊與和田紅羊群體中，g.75132817C>T、g.75320741G>A 2個位點(diǎn)的野生型的基因型頻率高于雜合型和突變型的基因型頻率，而g.75320579G>A位點(diǎn)的野生型基因型頻率低于雜合型的基因型頻率，說明g.75320579G>A位點(diǎn)在這2個群體中的突變發(fā)生率較高。3個位點(diǎn)在3個群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。在3個綿羊群體中，F(xiàn)SHR基因g.75132817位點(diǎn)的C為優(yōu)勢等位基因；g.75320579位點(diǎn)的G為優(yōu)勢等位基因；g.75320741位點(diǎn)的G為優(yōu)勢等位基因(表2)。FSHR基因g.75132817C>T位點(diǎn)在3個群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25A和g.75320741G>A 2個位點(diǎn)在3個綿羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25)；g.75320579G>A位點(diǎn)在阿勒泰羊群體中的雜合度最低(表3)。對3個位點(diǎn)的連鎖情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個位點(diǎn)在3個綿羊群體中均不存在強(qiáng)連鎖不平衡效應(yīng)(表4)。

2.3 FSHR基因的3個位點(diǎn)與不同品種羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

g.75132817C>T位點(diǎn)多態(tài)性與和田紅羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著關(guān)聯(lián)性(P<0.05)，突變型TT個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于野生型CC個體。此位點(diǎn)的突變降低阿勒泰羊的產(chǎn)羔數(shù)，增加吐魯番黑羊與和田紅羊的產(chǎn)羔數(shù)；g.75320579G>A位點(diǎn)多態(tài)性與阿勒泰羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著關(guān)聯(lián)性(P<0.05)，野生型GG個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于雜合型GA個體。此位點(diǎn)的突變降低阿勒泰羊的產(chǎn)羔數(shù)，增加和田紅羊的產(chǎn)羔數(shù)；g.75320741G>A位點(diǎn)多態(tài)性與阿勒泰羊和吐魯番黑羊的產(chǎn)羔數(shù)均有關(guān)聯(lián)性，在阿勒泰羊群體中，野生型GG個體產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于雜合型GA個體和突變型AA個體(P< 0.01)，突變導(dǎo)致阿勒泰羊產(chǎn)羔數(shù)降低；吐魯番黑羊群體中，突變型AA個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于野生型GG個體(P<0.05)，突變導(dǎo)致吐魯番黑羊產(chǎn)羔數(shù)增加；和田紅羊群體中，不同基因型產(chǎn)羔數(shù)的差異不顯著(表5)。

A:g.75132817C>T;B:g.75320579G>A;C:g.75320741G>A；下同 The same below

圖2 吐魯番黑羊FSHR基因3個位點(diǎn)的分型圖Fig.2 KASP results of three loci of FSHR gene in Turpan black sheep

圖3 和田紅羊FSHR基因3個位點(diǎn)的分型圖Fig.3 KASP results of three loci of FSHR gene in Hetian sheep

表2 綿羊FSHR基因不同位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率Table 2 Frequencies of genotype and gene in different loci of FSHR genes in sheep

表3 FSHR基因3個位點(diǎn)在不同綿羊群體中的群體遺傳學(xué)分析Table 3 Population genetics analysis of three loci of FSHR genes in different sheep populations

表4 不同綿羊群體FSHR基因SNPs 位點(diǎn)連鎖不平衡分析Table 4 Analysis of linkage disequilibrium of SNPs of FSHR gene in different sheep populations

表5 FSHR基因SNPs位點(diǎn)各基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association analysis of each genotype of FSHR gene SNPs locus with litter size

3 討 論

3.1 FSHR基因多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)系

對哺乳動物FSHR基因多態(tài)性與繁殖性狀之間的關(guān)系研究較多。研究表明，F(xiàn)SHR基因在動物的繁殖中起關(guān)鍵作用[23-24]。吳井生等[25]對梅山豬的產(chǎn)羔數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因第10外顯子存在 2 個多態(tài)位點(diǎn)，這 2 個位點(diǎn)對小梅山豬產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)FSHR基因第10外顯子有3個SNP位點(diǎn)(C1 491T、G1 885A、C1 977T)，結(jié)果表明這些SNP可作為豬品種選育的分子標(biāo)記。Chu等[27]在湖羊FSHR基因的5′側(cè)翼區(qū)域發(fā)現(xiàn) 2 個突變(g.681T> C和g.629C> T)和小尾寒羊中3個新突變(g.200G> A，g.197G> A和g.98T> C)這5個突變位點(diǎn)均與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。Pan等[28]在小尾寒羊和湖羊中發(fā)現(xiàn)FSHR基因的5′側(cè)翼區(qū) 1 個新的突變位點(diǎn)(g.47C> T)，此位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)。Wang等[29]同樣發(fā)現(xiàn)FSHR基因的位點(diǎn)(g.47C>T)與小尾寒羊和湖羊的產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。FSHR基因在山羊中也有研究，潭廣梅等[30]對海門山羊FSHR基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)野生型比突變純合型基因型多0.34只，等位基因與海門山羊產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。馬向明等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在波爾山羊FSHR基因5′上游處檢測1個SNP(G-739A)，該突變與平均排卵數(shù)(P<0.01)及平均胚胎可利用率顯著相關(guān)。FSHR基因在豬、羊中均有研究，研究最多的為FSHR基因的第10外顯子。在陳祥等[22]的研究中，F(xiàn)SHR基因第1外顯子的突變在黔北麻羊和貴州黑山羊群體中存在3種基因型，與本研究中FSHR基因第1外顯子 (g.75132817)的結(jié)果一致。

3.2 FSHR基因與阿勒泰羊、吐魯番黑羊、和田紅羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

本研究中，g.75132817位點(diǎn)G突變?yōu)锳，導(dǎo)致丙氨酸(Ala)變?yōu)樘K氨酸(Thr)；g.75320579位點(diǎn)G突變?yōu)锳，導(dǎo)致精氨酸(Arg)變?yōu)榻M氨酸(His)；g.75320741位點(diǎn)C突變?yōu)門，導(dǎo)致蘇氨酸(Thr)變?yōu)楫惲涟彼?Ile)。群體遺傳學(xué)分析結(jié)果表明，F(xiàn)SHR基因g.75132817C>T位點(diǎn)在阿勒泰羊、吐魯番黑羊、和田紅羊群體中為中度多態(tài)，說明這個位點(diǎn)的選擇潛力比較大，而g.75320579G>A和g.75320741G>A 2 個位點(diǎn)在3個綿羊群體中為低度多態(tài)，說明這 2 個位點(diǎn)的選擇潛力較小?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明，3個位點(diǎn)在3個綿羊群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài) (P>0.05)，表明這3個位點(diǎn)在長期的選擇過程中已趨于穩(wěn)定。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，同一位點(diǎn)在不同綿羊群體中受到的選擇壓力不一致，g.75132817C>T位點(diǎn)在和田紅羊群體中，突變型TT個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于野生型CC個體，在吐魯番黑羊群體中，TT個體產(chǎn)羔數(shù)高于CC個體，但差異不顯著，在阿勒泰羊群體中，TT個體產(chǎn)羔數(shù)低于CC個體，說明此位點(diǎn)的突變一定程度上增強(qiáng)和田紅羊與吐魯番黑羊的產(chǎn)羔能力；g.75320579G>A位點(diǎn)在阿勒泰羊中，野生型GG個體產(chǎn)羔數(shù)高于于GA個體，說明此位點(diǎn)的突變一定程度上降低阿勒泰羊產(chǎn)羔能力；在和田紅羊中，GA個體產(chǎn)羔數(shù)高于GG個體的產(chǎn)羔數(shù)，說明此位點(diǎn)的突變增強(qiáng)和田紅羊的產(chǎn)羔能力；g.75320741G>A位點(diǎn)在和田紅羊和阿勒泰羊群體中突變型AA個體產(chǎn)羔數(shù)低于野生型GG個體，在吐魯番黑羊中，AA個體產(chǎn)羔數(shù)高于GG個體，說明此突變在一定程度上降低和田紅羊和阿勒泰羊的產(chǎn)羔能力，增強(qiáng)吐魯番黑羊的產(chǎn)羔能力。

不同位點(diǎn)基因型與不同綿羊品種產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)結(jié)果不同，在陳祥等[22]的研究中，黔北麻羊和貴州黑山羊群體中，F(xiàn)SHR基因(第1外顯子)突變的不同基因型個體之間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著，與本研究結(jié)果不同?？赡苁怯捎诘赜虿煌斐傻淖匀贿x擇不同或者是品種不同造成的，綿羊FSHR基因第1外顯子和第9外顯子的突變與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系具有種屬差異性。

4 結(jié) 論

研究表明FSHR基因g.75132817C>T、g.75320579G>A和g.75320741G>A 3個位點(diǎn)的多態(tài)性與阿勒泰羊、吐魯番黑羊、和田紅羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)聯(lián)性，3個位點(diǎn)的突變均導(dǎo)致阿勒泰羊產(chǎn)羔數(shù)降低；g.75132817C>T位點(diǎn)突變導(dǎo)致和田紅羊和吐魯番黑羊的產(chǎn)羔數(shù)升高，并且顯著提高和田紅羊的產(chǎn)羔數(shù)，說明此位點(diǎn)可作為和田紅羊選育的輔助標(biāo)記；g.75320741G>A位點(diǎn)的突變導(dǎo)致吐魯番黑羊產(chǎn)羔數(shù)升高，g.75320741G>A位點(diǎn)可作為吐魯番黑羊選育的輔助標(biāo)記。