薛 松，劉彩云，于 帆，林 劍

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264000；2.煙臺華海生物制品有限公司，山東煙臺 264000）

蜂蜜中含有糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及多酚類化合物等，所含物質(zhì)總數(shù)超出200 多種[1]，并且具有抑菌消炎、抗衰老、增強免疫力等多種生物活性功能，被認為是自然界中的天然保健品[2]。椴樹蜜擁有椴樹花濃郁清新的香味[3]，清新香甜，是東北特有的蜜種之一，其營養(yǎng)成分的含量高于普通蜂蜜。椴樹蜜中的高營養(yǎng)成分決定了其是一種天然的滋補品，但是由于其富含高含量的糖類物質(zhì)而使其飲用人群大大受限[4]，因此，將其制成一種適合多數(shù)人飲用的發(fā)酵飲料具有重要的應(yīng)用價值。

蜜酒具有十分悠久的歷史，曾經(jīng)被稱之為世界上最古老的酒精飲料，其出現(xiàn)的時間比之葡萄酒和啤酒都早約幾千年[5]。椴樹蜜酒是以椴樹蜜為原料，經(jīng)過發(fā)酵、過濾、陳釀后制成，研究表明，經(jīng)發(fā)酵釀制而成的蜜酒，除了蜂蜜本身所含的絕大部分葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為乙醇外，蜂蜜原有的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚類化合物和超氧岐化酶等成分得到保留[6]，因此，椴樹蜜酒既包含椴樹蜜原本的營養(yǎng)成分，又有發(fā)酵酒的醇香，是一種口感柔和的低度保健飲料酒[7]。

傳統(tǒng)的蜜酒釀造過程存在較多的問題，例如：發(fā)酵時間的延遲、發(fā)酵過程中不良風味的產(chǎn)生進而導(dǎo)致蜜酒產(chǎn)品的感官品質(zhì)降低。因此，以科學的手段提高蜜酒的品質(zhì)是目前研究的關(guān)鍵所在[8]。酵母菌是蜜酒釀造過程中最為關(guān)鍵的所在，不同酵母在發(fā)酵過程中，由于代謝產(chǎn)物種類和含量的差異，發(fā)酵所得產(chǎn)品的質(zhì)量和類型也有所不同[9]，因此研究人員在釀制蜜酒的過程中通常會對酵母進行選擇，如史瑩[10]從烏桕蜂蜜中篩選出1 株釀酒酵母，相比較對照組的酵母更耐酒精，而且發(fā)酵所得的蜜酒口感更出色。因此，優(yōu)選出最適的椴樹蜜酒酵母是椴樹蜜酒發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵問題。

長期以來，國內(nèi)外的科研人員大多采用單一的方法對發(fā)酵酒進行評價，馮紅艷等[11]采用氣相色譜法測定啤酒中的風味物質(zhì)，為啤酒生產(chǎn)確定最佳工藝參數(shù)；黃琳等[12]單一以感官評分為評價指標，研究了不同發(fā)酵條件對啤酒感官品質(zhì)的影響。以單一因素對蜜酒產(chǎn)品進行評判，因多方面的原因會導(dǎo)致實驗結(jié)果不夠準確，進而誤導(dǎo)對產(chǎn)品的最終評判。本研究以椴樹蜜酒感官得分同時聯(lián)合氣相色譜技術(shù)，通過模糊綜合評判法對蜜酒進行綜合評價，進而優(yōu)選酵母，為椴樹蜜酒發(fā)酵過程中活性干酵母的優(yōu)選提供更加準確、科學、可信的評判結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 酵母菌株

選用葡萄酒釀造過程中廣泛使用的活性干酵母，分別編號為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8，由煙臺帝伯仕自釀機有限公司提供。

1.1.2 椴樹蜜

中蜂國際生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（Waters 1525），美國Waters 公司；氣相色譜儀（Agilent 7890A），美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 椴樹蜜酒精發(fā)酵工藝流程

椴樹蜜→調(diào)整可酵解糖濃度和pH 值→滅菌→接種→發(fā)酵→過濾、除菌→椴樹蜜酒樣

操作條件：調(diào)整培養(yǎng)基中可酵糖含量為160 g/L，添加2 ‰的酵母浸出物作為外加氮源，磷酸調(diào)整pH5.5，120 ℃滅菌20 min，冷卻后待用。將活性干酵母在25 ℃條件下靜置復(fù)水活化30 min[13]，按照2 %的接種量接種到培養(yǎng)基中。25 ℃條件下進行發(fā)酵[14]，每隔24 h取樣1次，對樣品離心、抽濾，采用高效液相色譜法測定樣品中的還原糖和酒精含量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 發(fā)酵液中還原糖的測定——高效液相色譜法

色譜條件[15]：流動相0.01 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫50 ℃。

1.2.2.2 發(fā)酵液中酒精的測定——高效液相色譜法

色譜條件：流動相0.01 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫50 ℃，示差折光檢測器溫度50 ℃。

1.2.2.3 發(fā)酵液中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定——氣相色譜法

色譜條件[16]：檢測器溫度280 ℃，進樣溫度100 ℃，進樣時間1 min，樣品瓶壓力1.39×105 Pa，載氣為N2（99.999 %），流速為4 mL/min，H2流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min。

1.3 椴樹蜜發(fā)酵所得酒樣的感官評價

感官評價組由2 名發(fā)酵專業(yè)老師及12 名相關(guān)專業(yè)學生組成，按照表1 評分標準對8 株不同活性干酵母發(fā)酵所得酒樣進行評分。

1.4 活性釀酒干酵母的優(yōu)選

通過比較8 株不同活性釀酒干酵母的發(fā)酵性能，綜合椴樹蜜酒精樣品的感官得分及其所含揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量，利用模糊綜合評判法優(yōu)選出最佳椴樹蜜酒釀造活性干酵母。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酵母發(fā)酵性能的比較

參照方法1.2.2.1 和1.2.2.2，對8 種不同菌株發(fā)酵能力的測定結(jié)果見圖1、圖2。

由圖1 和圖2 可以看出，F(xiàn)1 和F5 菌株無論是在底物還原糖的消耗還是產(chǎn)物乙醇的生成速度方面都是較慢的，說明其發(fā)酵能力相對較弱；F4 菌株較剩下其余菌株的發(fā)酵能力較強；菌株在前6 天發(fā)酵速度相對較快，在第6 天以后，由于底物濃度的減小以及產(chǎn)物濃度的增大，產(chǎn)生阻遏作用，菌株的發(fā)酵速度減慢，相對平緩，在第9天時，發(fā)酵結(jié)束。

表1 感官評分細則表

2.2 不同菌株發(fā)酵椴樹蜜酒中香氣成分含量的測定及感官評分

參照方法1.2.2.3和1.3，對8株不同酵母菌株發(fā)酵所得蜂蜜酒中香氣成分含量的感官得分及測定結(jié)果見表2和表3。

表2 不同椴樹蜜酒樣的感官得分

高級醇和酯類是酵母正常發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，也是組成酒類風味的重要成分[17]，是酒類香氣的主要載體，賦予酒類醇厚感。實驗共選取7 種對蜂蜜酒風味影響較大的物質(zhì)進行分析，結(jié)合表2 感官評分發(fā)現(xiàn)，感官評分得分較高的酵母菌株，相對應(yīng)蜂蜜酒香氣成分中高級醇和酯類物質(zhì)的含量也略高于其他菌株。

表3 不同椴樹蜜酒樣中主要香氣成分的定量分析結(jié)果

2.3 模糊綜合評判法優(yōu)選最佳活性干酵母

2.3.1 建立評判對象集

2.3.2 建立評判因素集

根據(jù)已有文獻報道[18]，確定高級醇和酯類為椴樹蜜酒中的主要揮發(fā)性成分，同時結(jié)合表2 的感官評分，建立評判因素集為X={x1，x2……，xn}={x1，x2，x3}，其中x1—感官評分，x2—高級醇類，x3—酯類。

2.3.3 建立隸屬函數(shù)模型

根據(jù)表2 構(gòu)造感官評分因素的隸屬函數(shù)（感官評分低于70分的樣品不參與評價）：

U（x1）=x1/100，70≤x1＜100

椴樹蜜酒香氣成分的含量在一定范圍內(nèi)與椴樹蜜酒的品質(zhì)呈正相關(guān)，所以可以構(gòu)造高級醇和酯類的線性上升隸屬函數(shù)[19]，結(jié)合表3 構(gòu)造隸屬函數(shù)如下：

2.3.4 建立權(quán)重集

研究表明，高級醇和酯類對酒類產(chǎn)品的香氣影響較大，且酯類的影響更加明顯，結(jié)合感官評價，根據(jù)德爾菲法（Delphi technique）[20]確定權(quán)重分配為A={a1，a2……，an}={a1，a2，a3}={0.35，0.3，0.35}，其中

2.3.5 模糊綜合評判計算

對Ui的每個因子利用U（xi）進行模糊化，可得到x×y上的模糊矩陣R：

利用模糊線性變換法得到的評判結(jié)果為：

B=A × R=[0.623 0.649 0.727 0.794 0.559 0.899 0.613 0.841]，

其中，模糊算子為M（·，⊕），即，（j=1，2，k，n），歸一化處理得：

B=[0.109 0.113 0.127 0.139 0.097 0.157 0.107 0.147]

模糊綜合評判的結(jié)果椴樹蜂蜜酒品質(zhì)方面體現(xiàn)出不同釀酒酵母的優(yōu)劣，結(jié)合上述8 株不同活性干酵母發(fā)酵性能測試結(jié)果可以得出各酵母菌株的優(yōu)劣：F6＞F8＞F4＞F3＞F2＞F1＞F7＞F5?？梢钥闯鯢6 酵母為最佳椴樹蜜酒發(fā)酵酵母，F(xiàn)8 和F4 次之，F(xiàn)5酵母菌株發(fā)酵性能最差。

3 結(jié)論

本研究測定了發(fā)酵過程中8 株不同釀酒活性干酵母菌株對底物的消耗速率及產(chǎn)物的生成速率，以所得不同酵母菌株的發(fā)酵性能作為參照，結(jié)合不同酵母菌株發(fā)酵所得椴樹蜜酒樣感官評價得分以及其所含揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的測定，利用模糊綜合評判的方法優(yōu)選出F6 酵母為最佳椴樹蜜酒釀酒活性干酵母，后續(xù)仍需對優(yōu)選出的酵母菌株做深入的發(fā)酵過程動態(tài)研究。本方法對于其他酒類飲品所用最佳釀酒酵母的優(yōu)選也具有一定的參考意義，為酵母的優(yōu)選提供了一種更科學、可信的途徑。