林長纓, 丁曉靜

(北京市疾病預防控制中心, 食物中毒溯源技術北京市重點實驗室, 北京市預防醫(yī)學研究中心, 北京 100013)

疾病預防控制系統(tǒng)(以下簡稱“疾控”)主要承擔傳染性疾病、慢性非傳染性疾病、病媒生物傳播疾病等監(jiān)測與控制,食品衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、放射衛(wèi)生和職業(yè)衛(wèi)生健康危害因素的監(jiān)測與干預任務;突發(fā)公共衛(wèi)生事件如食物中毒的應急處置等。除此之外,還需要進行應用研究,研究對象涵蓋生活飲用水中的無機陰、陽離子到病原微生物中核酸等生物大分子。這正好與毛細管電泳(CE)技術擅長的分析對象(從無機離子到細胞)相吻合。CE技術除具有分離時間短、分析效率高、試劑用量少的優(yōu)勢外,還有一項不可替代的優(yōu)勢:方法一旦被充分驗證,無需篩選等效色譜柱[1],也無需使用特定的色譜柱[2],可以有效解決色譜柱的選擇性[3]不同造成的色譜峰順序改變的普遍情況[4]。作者單位曾舉辦過CE在疾控系統(tǒng)應用的學習班,并安排了現場實驗:醬油中山梨酸和苯甲酸的測定及飲料中甜蜜素的測定,現場實驗結果方法重現性好,與教科書[5]中電泳圖的出峰時間基本一樣,可見經過充分優(yōu)化與細致描述的方法易于再現。再加上對細微之處操作的控制,對重現性、再現性和可靠性結果的關鍵把控[6],完全能夠開發(fā)重現性和耐用性好[7]、靈敏度高[8]的方法,這也更加充分地體現CE技術在疾控系統(tǒng)應用的優(yōu)勢。

但是,目前我國省級以上疾控機構CE儀器擁有率不足1%,遠不如1955年推出的商用氣相色譜(GC)、1967年推出的商用液相色譜(LC),更是遠遠落后于與CE同時起步LC/質譜(MS)的普及率。這是因為LC-MS憑借接口商品化迅速、強大的定性和定量能力,解決了當時急需的食品安全等問題,于2005年之后陸續(xù)進入各級標準得以推廣,成為省級疾控實驗室的標配,并作為不可或缺的常規(guī)和科研檢測設備,成為解決實際問題時的首選,造成了“色譜難以分離就寄厚望于質譜檢測”的現狀。但我國目前LC/MS聯用儀國產能力不足;對同位素內標的依賴造成檢測成本增加;樣品難以凈化,易污染系統(tǒng),影響靈敏度。盡管通過清洗離子源,可以解決污染問題,但長此以往,會影響儀器性能。

CE因商業(yè)起步較晚[9],性能較好的儀器品牌少、普及率不高、市場認可率不及LC等原因[10,11],較少進入各級標準。事實上,經過30多年的發(fā)展,CE已經逐步成熟,在多個應用領域(如在樣品量極為稀少的交鏈孢菌毒素[12]二級標準物質定值方面)均有出色表現[13],盡管如此,CE方法在各級標準普及和推廣方面還存在阻礙因素[14]。2018年,美國、英國、歐洲、日本、印度、巴西、俄羅斯和中國已在農業(yè)、環(huán)保、食品、飲料、化工、制藥方面制定了83個CE標準方法[15]。其中,我國有5項標準,《中國藥典》2015版收錄了4項,行業(yè)標準SH/T 1687-2000轉換而來的國家標準1項。該國家標準是關于工業(yè)用精對苯二甲酸(PTA,大宗化學品,2018年底全球產能已達到8 800萬噸/年)質量的檢測方法,分別用CE和LC對其中兩個主要痕量雜質對甲基苯甲酸和4-羥基苯甲醛進行分析,CE法分離時間短、靈敏度更高[16]。 2020年3月31日，我國又發(fā)布并實施了水產源致敏性蛋白快速檢測的毛細管電泳法國家標準(GB/T 38578-2020)。可喜的是,近年來國產CE儀器公司大幅度增加,目前已達近40家[15]。這為CE技術在我國的推廣應用提供了重要的前提。

本文主要從6個方面討論CE技術在疾控系統(tǒng)應用研究工作中遇到的問題、機遇和挑戰(zhàn)。

1 疾病防控中的應用

30多年前,CE作為異型血紅蛋白的分離工具[17],以極高的分離速度和極低的檢測費用廣受歡迎。基于CE方法直接分離病原微生物[18]和某些變異分析[19]的結果均令人滿意,但操作稍顯復雜,在結果判斷上并不十分直觀,加之使用者要了解CE的分離原理,因此應用逐漸減少。盡管如此,CE對生物大分子的分析研究證明了兩者之間無與倫比的兼容性[20],這也使CE成為傳染病檢測工作中不可或缺的技術。

1.1 聚合酶鏈式反應(PCR)產物分析

DNA分析是傳染病檢測中最為常見的研究對象。作為常量分析工具,CE檢測PCR產物成為疾病檢測的重要工具之一,也是CE最為廣泛的應用。通過PCR引物設計,可以特異性擴增某種病原微生物特定位置上的核酸片段,使用CE分離PCR產物,通過遷移時間判斷擴增的片段長度,從而確定是否存在某種病原微生物。這項技術已經成為眾多微生物實驗室必備,幾乎可以檢測所有病原微生物。日常檢測中,常用CE與多重PCR(在一個反應體系中進行多組PCR)聯用,同時檢測多種病原微生物或型別,其借助的正是CE高分辨率的優(yōu)勢[21,22]。Jiang等[23]建立了13種病原微生物的多重PCR擴增和CE分離鑒定方法,包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、軍團菌、百日咳桿菌、結核菌、白喉桿菌和A群鏈球菌。針對這些病原微生物的16S rRNA基因等多個基因的序列設計多種引物,其中正向引物5′端用5′-羧基熒光素(FAM)進行熒光標記。這些引物分為3組進行多重PCR,產物長度從93個堿基對(bp)到903 bp,片段間差異最小為17 bp。在ABI 3730 DNA分析儀上使用商品化分離膠和DNA標準品,分離3個多重PCR產物的混合物,所有產物峰均完全分離且重復性良好,檢出限為10-7～10-2mg/L核酸?？笛氲萚24]根據恙蟲病東方體、嗜吞噬細胞無形體、莫氏立克次實體、土拉弗朗西斯菌、貝氏柯克斯體、問號鉤端螺旋體和巴爾通體的特異性基因,構建特異性嵌合引物多重PCR方法,用CE分離擴增產物并鑒定這些重要鼠傳疾病。該方法中CE的分辨率是瓊脂糖電泳的10倍以上,CE-多重PCR方法的靈敏度與實時熒光PCR相當,在實際樣本檢測中陽性率達到普通PCR方法的3倍以上。Hu等[25]建立了基于GeXP多重PCR的腸道病毒(EV)檢測方法,可通過PCR片段長度區(qū)分中國常見多種手足口病原微生物,如EV71、A組柯薩奇病毒(CVA)16和CVA 4、5、9、10以及B組柯薩奇病毒(CVB) 1、3和5,其中片段長度差異最小為12 bp。核酸檢測相對比較簡單,而且靈敏度超高,但是很容易出現實驗室環(huán)境被PCR產物污染的情況,造成假陽性。因此采用CE分析PCR產物時必須在特定的房間中進行。應用熒光探針技術的實時熒光PCR技術在很大程度上能夠解決產物分析時的污染問題,但擴增片段較短,無法用于測序,因此,CE-PCR依然在測序分型檢測中有應用。

1.2 核酸序列測定

目前,基于CE原理的第一代核苷酸序列測定已經發(fā)展成為完全成熟的常規(guī)技術,常用于傳染病病原微生物檢測和PCR產物核苷酸序列測定(簡稱測序)。雖然通過引物設計可以確定PCR產物長度,并在CE圖譜上直接進行判定。但也會有例外。如病毒在復制過程中有可能出現核酸的插入、缺失、重組等,可能造成片段長度發(fā)生變化,就需要對PCR產物測序進行驗證。此外,基因分型檢測需要在CE分離的基礎上進行測序,從而判定病毒的基因型。比較典型的應用是諾如病毒感染疫情中對病毒的分型鑒定。劉園等[26]在同一地點連續(xù)3次諾如病毒疫情的檢測中,首先對諾如病毒核衣殼蛋白基因進行逆轉錄(RT)-PCR, CE分離的陽性PCR產物為344 bp的DNA片段,經測序和序列比對后發(fā)現3次疫情由不同型別的病毒引起,從而認為未能正確消毒是導致疫情連續(xù)出現的原因。這種特定基因片段擴增與CE為基礎的測序聯用的方式可鑒定絕大多數病原微生物,但測序只是此類研究中不可或缺但又是很小的組成部分,因此本文不再贅述此類方法在其他病原微生物鑒別中的應用。Clarridge[27]綜述了細菌性傳染病檢測中,細菌核糖體16S rRNA編碼基因測序分析對臨床微生物學和傳染性疾病的影響。對于厭氧菌、生長緩慢的細菌以及難以根據生化特征進行鑒定的細菌而言,16S rRNA是非?？煽亢头奖愕蔫b定方法。為了滿足基因組研究中測序的高通量要求,第二代測序技術應運而生。雖然測序原理已經和CE沒有任何關系,但芯片毛細管電泳依然可作為第二代測序文庫制備中的質量控制工具,對原始基因組DNA、文庫長度分布情況、未反應的接頭比例、文庫擴增效率等文庫質量參數進行評估[28]。芯片毛細管電泳已超出了本文討論范圍。

1.3 變異和分型分析

對DNA變異的檢測和在此基礎上的分型分析是CE的一項重要應用。核酸變異通常需要PCR產物測序檢測核酸變異,但測序程序相對復雜,而且發(fā)生變異的情況比較罕見,通常使用一些快速篩選方法檢測到變異,然后對變異片段進行測序驗證。當前變異研究的熱點之一是對單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)的檢測,主要用于癌癥等疾病的分型、風險評估等,在傳染病疫情的流行病學調查和溯源中也有一定應用。Studzińska等[29]對toll樣受體3和7基因上的5個SNP分型與巨細胞病毒感染相關性進行了研究,采用限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術,使用QIAxcel自動化CE儀器和商品化DNA篩查試劑盒,根據不同的電泳條帶組合確定了SNP基因型。通過比較感染和未感染巨細胞病毒的患兒基因型發(fā)現TLR3 L412F雜合子是感染的風險因子。2019年Takahashi等[30]建立非雜交法的CE檢測SNP技術。應用CE可以在未雜交的基礎上區(qū)分出只有一個堿基差別的DNA片段。該方法的特點之一是采用了酸性分離條件(8 mol/L尿素和0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液)區(qū)分不同堿基的解離程度。在ALDH-2基因的84-mer單鏈DNA中僅有一個G/A突變。CE能夠完全分離正常的單鏈DNA及其互補鏈、突變的單鏈DNA及其互補鏈。

片段分析中采用非變性CE分離單鏈或雙鏈DNA會獲得一些有趣的結果。單鏈DNA在非變性條件下快速變性后復性時,會出現單鏈內部堿基配對的現象,形成特定的單鏈構象,這種構象決定于核苷酸序列。非變性CE能夠分離長度相等但序列不同的單鏈。這項技術稱為單鏈構象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)。在細菌性疾病的分子診斷方法中,CE-SSCP能夠發(fā)現單堿基變異,基于CE-SSCP結合16S rRNA基因片段PCR技術,能以簡單的步驟分離序列變異,各標記峰基線分離良好,具有特征性遷移率,便于病原微生物鑒定。Lin等[31]采用巢式PCR和CE-SSCP分析了肺炎支原體23S rRNA基因上耐藥變異,采用線性聚丙烯酰胺和聚乙二醇20 000和三羥甲基氨基甲烷-硼砂-乙二胺四乙酸(TBE)緩沖液(pH 8.3)作為篩分介質,能夠快速鑒定肺炎支原體紅霉素耐藥變異株。傳統(tǒng)的CE-SSCP系統(tǒng)分辨率有限,不能將大多數16S rRNA基因特異性標記分離成單獨的峰。Phillips等[32]報道高分辨率的CE-SSCP體系可以有效地分離高度相似的PCR產物,實現了12種病原微生物同時檢測的方法。

另外一個與核酸片段長度有關的DNA片段分析方法是多位點串聯重復多態(tài)性分析(MLVA),通過細菌基因組中多個串聯長度多態(tài)性位點(VNTR)的重復數來區(qū)分各種菌株。劉桂榮等[33]在宋內志賀菌中10個VNTR位點,采用3730 DNA分析儀和商品化試劑盒對在北京市分離到的50株志賀菌進行MLVA分析,發(fā)現了21個型別,為預測志賀菌流行奠定了基礎。

1.4 食源性致病菌分析

病原微生物引起的食源性疾病是一個巨大、廣泛且日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的技術非常耗時,難以實現大規(guī)模篩查。Roda等[34]綜述了1999～2012年食品基質中病原微生物快速生物分析方法的進展,并特別強調了為實現多種病原微生物同時檢測設計的技術解決方案。Zhou等[35]建立了一種以SYBR Gold為核酸熒光染料,結合雙重PCR檢測食品中致病性小腸結腸炎耶爾森菌的毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)新方法。小腸結腸炎耶爾森菌是一種革蘭氏陰性的小桿狀細菌,在食物、水和其他自然樣品中普遍存在,并能在冷藏中生存。目前至少有3起由小腸結腸炎耶爾森菌引起的疫情報道。歐洲、新西蘭和美國已將小腸結腸炎納入國家常規(guī)監(jiān)測網絡。CE-LIF法避免了PCR-瓊脂糖凝膠電泳的缺點,可以檢測低濃度的細菌。與表型試驗相比,可快速、靈敏、可靠地區(qū)分致病菌株和非致病菌株。

與細菌相比,以輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒等腹瀉病毒為主的病毒正在成為全球性的公共衛(wèi)生問題。張建明等[36]綜述了CE在病毒學研究領域的應用。與生物樣本不同,食品的成分非常復雜,還有可能含有PCR抑制劑成分,使得食品的病毒核酸提取和后續(xù)擴增反應更加困難,除上述PCR加測序的方法外,以CE為基礎的、靈敏可靠的食品中病毒的檢測方法較少。Ruan等[37]建立了以SYBR Gold為核酸染料,經堿性緩沖液洗脫-聚乙二醇沉淀后的RT-PCR檢測各種蔬菜樣品中的食源性腸道病毒的CE-LIF新方法。該法操作簡單,環(huán)境友好,不需要昂貴的儀器和探頭,這使得它特別適用于發(fā)展中國家。

如前所述,PCR是DNA/RNA分析的支柱,理想情況下能夠檢測到一個或幾個目標分子。然而,在分析食品或法醫(yī)樣品時,經常受到低質量模板分子和復雜基質的挑戰(zhàn)。Hedman等[38]綜述了生物恐怖主義防備、食品安全和法醫(yī)學中PCR工作流程的驗證指南,在發(fā)生食源性疫情或需要分析大量不同樣本的犯罪事件時,能夠進行合理的內部驗證,以實現可靠和快速的質量保證。

1.5 疫苗分析

賽諾菲-安萬特、默克和惠氏等疫苗制造商都在用CE進行疫苗分析[39]。Nunnally等[40]基于有限的24篇文獻和參加的學術講座,綜述了CE分析疫苗的進展,認為制藥公司因保密的原因,導致CE在疫苗分析中的實際使用情況被低估。

Hsieh等[41]用CZE-UV方法鑒定和表征傳染性法氏囊病病毒亞病毒顆粒,為疫苗生產過程中的質量控制、對病毒感染產生的血清抗體的監(jiān)測或疫苗免疫提供了支持。van Tricht等[42]利用在線CZE快速而準確地測定腺病毒在疫苗生產中的濃度,目的是取代標準的定量聚合酶鏈反應(qPCR)方法,后者需要至少一天的時間才能對一個樣品獲得可靠的結果;同時,用統(tǒng)計學方法評價了CZE和qPCR方法之間的等效性。CZE法從采樣到報告結果的時間不到2 h,而qPCR需要3 d,可見CZE法在下游分析中所需時間更短。研究團隊對來自分析方法的關鍵數據進行廣泛的系統(tǒng)適用性測試和趨勢分析,確保經過2年的運行,在525次分析后,該方法的精密度和偏差仍符合要求。Rustandi等[43]以單克隆抗體(MAb)、Enbrel、CRM197和彌散性梭菌(Clostridium Diffi Cile)疫苗蛋白為例,說明了基于CE的Western Blot技術的實用性,測定了4種來自白念珠菌疫苗的毒素蛋白。van Tricht等[44]還建立了快速準確鑒定和定量流感疫苗中多種病毒蛋白的毛細管凝膠電泳(CGE)新方法。CGE法可在與LC法相同的分析物濃度范圍內使用,但具有更好的精密度和準確度。總體而言,CGE方法的總分析時間要短得多,可在4 d內分析100個樣品,而單細胞免疫擴散(SRID)需10 d。吳蘊怡等[45]建立了CZE分析腸道病毒71型滅活疫苗純度的新方法,為該疫苗的質量研究、工藝過程控制及穩(wěn)定性研究奠定了基礎。用CE測定腦膜炎球菌結合疫苗原液中二甲亞砜殘余量、四價輪狀病毒疫苗原液中蔗糖含量也已見文獻報道[46,47]。

綜上,CE已被證明是疫苗表征的一種極好的替代技術。對于分析者來說,CE提供了自動化程度高,更容易的方法開發(fā)/驗證。與使用各種不同的方法和不同的技術相比,僅用CE就能夠監(jiān)控10步過程的每個步驟中的重要參數[48],完全滿足包括疫苗定量、純度、pI測定、過程監(jiān)控、表征和核酸分析的要求。由于疫苗分析需要分子生物學、生物化學、免疫學和病毒學以及分析化學多學科聯合,導致CE在疫苗分析中的巨大應用潛力還未被充分挖掘,有進一步提升的空間。

2 食品(保健食品、特醫(yī)食品)中營養(yǎng)或限量物質的分析

在分離結構相似的化合物方面,CE比LC具有更好的效率[49],容易被忽略的事實是:第一,LC流動相和GC前處理消耗的大量有機溶劑很難回收[50],盡管一些超高效液相色譜(UPLC)極大地減少了有機溶劑的消耗,但與CE相比仍相當可觀。第二,GC或LC經常需要衍生或凈化樣品等,樣品前處理需要的耗材多,分離用的色譜柱較昂貴[51-53],對一些需要控制成本的第三方檢驗機構或經費不足的單位,成本較高。第三,極性分子在普通LC非極性色譜柱上的保留弱,難以與弱保留的食品基質分離。即使采用離子對試劑、改變色譜柱類型等手段改善分離,但仍然存在或多或少的干擾,盡管通過更換色譜柱和流動相或通過二極管陣列檢測器輔助排除假陽性,但實際效果十分有限,因為分離機理沒有根本變化。第四,GC或GC-MS樣品前處理繁瑣復雜,如甜蜜素[54]等,檢測1個樣品(從稱樣、前處理直至上機測定)往往需要1 d的時間,因為前處理花費半天,而CE則可以在1 h內完成[55,56]。

CE已顯示出在具有挑戰(zhàn)性的食品分析中的巨大應用潛力[57],有代表性的應用實例如飲料[58]、牛奶[59,60]、面粉[61]、魚[62]、豆芽[63]、橄欖油[64,65]、食用油[66]、蔬菜[37]、醬油[67,68]、啤酒[69]、紅酒[70]、茶葉[71]、嬰兒配方奶粉[72-74]、功能食品[75,76]、蜂蜜[77]、豬肉和魷魚[35]、特殊醫(yī)學用途配方食品[78]、海藻[79]、蜂王漿[80]等。CE不僅是分析強極性和稀少樣品的有力工具,而且也是檢查中成藥中違法添加西藥的利器,因為西藥添加量必須達到藥物的劑量(高達上千個mg/kg[76])才能起作用,顯然利于CE分析。

CE還可為樣品前處理提供新思路。工業(yè)染料因著色牢固、價廉、高溫穩(wěn)定以及較少添加量即可達到理想著色效果[81],被濫用于食品著色。文獻報道的堿性橙2的LC或LC-MS法受限于色譜柱,不能用太強的酸或堿提取,通常用甲醇-乙腈[82]、乙醇[83]、酸化甲醇[84]或堿化甲醇[85]、乙腈[86]、酸化乙腈[87]、堿化乙腈[88]等提取。LC的回收率一般在77.8%～83.6%之間[89],難以達到90%。我們的研究表明:只有60%乙腈聯合20%乙酸才能有效提取,堿性橙2的回收率在90%。CE提取劑不受毛細管的限制,酸、堿、表面活性劑、有機溶劑等均可選擇。LC-MS檢測方法[90]首先用1 mol/L HCl提取,之后再調節(jié)pH,最后用SPE柱凈化,過程繁瑣且增加了檢測成本。由此可見CE是分析著色劑的首選。

CE對食品衛(wèi)生變得越來越重要且應用前景廣闊。董亞蕾等[91]和Lara等[92]分別綜述了2009～2012年、2008～2018年CE在食品安全分析中的應用。Lara認為CE在食品常規(guī)分析中取得了重要進展,樣品前處理并不是CE的瓶頸[92]。Ibáez等[93]綜述了2011～2014年CE在食品和食品組學中的應用。de Oliveira等[94]綜述了1995～2015年這20年CE分析食品中氨基酸、蛋白質、碳水化合物和脂質的研究進展,并指出CE是工業(yè)和政府實驗室進行質量控制的有力工具。Papetti等[95]綜述了CE技術的歷史、原理和應用以及2003～2017年CE在不同類型食品中最重要的應用進展,顯示出CE從小分子到大分子(離子、藥物、蛋白質、天然產物)分析中巨大的應用潛力。成為食品質量和安全、食品加工和穩(wěn)定性以及食品工業(yè)的重要分析工具。

食品化學家、監(jiān)管機構和質量控制實驗室都在尋求更強大、更清潔和更便宜的分析方法[96],食品分析目前正朝著綠色分析化學方向發(fā)展[96],這對綠色環(huán)保的CE技術是利好。但CE易于受溫度、吸附、納升進樣量的精度等因素影響,CE準確定量的關鍵就是了解并控制這些影響因素[7]。法規(guī)實驗室在使用CE之前,必須進行充分驗證,以證明新開發(fā)的CE方法不是那些僅用標準溶液測試的性能良好的方法,否則,它很難被接受為標準方法[97]。

3 化妝品中禁限用物質的分析

由于化妝品為重要的全球產業(yè),各國對化妝品均進行嚴格監(jiān)管,以保證其安全。但生產企業(yè)違法行為時有發(fā)生,例如故意使用禁用物質或過量使用限用物質、非法添加、標簽上聲明的成分與實際不一致等。我國由化妝品質量引起的各類皮膚不良反應等安全問題時有發(fā)生[98,99]。檢驗機構應依據《化妝品安全技術規(guī)范》(2015版)(以下簡稱《規(guī)范》)對上市前或監(jiān)督抽檢的化妝品進行依法檢驗。目前《規(guī)范》中禁限用組分共收錄1 745種,配套的理化檢驗方法77個[100],涉及304種組分,這就意味著1 441種組分無相應檢測方法。擅自非法添加法定檢驗方法之外的速效美容化合物的現象已相當普遍[3,101]。另外,各國關于化妝品的法律法規(guī)不同,在我國禁用的中藥成分,在韓國則允許添加[102],這也給化妝品檢驗帶來了挑戰(zhàn)?；瘖y品成分復雜,基礎配方一般包括:油脂、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、色素、香料等。某些特殊用途化妝品還添加保濕劑、增稠劑、染發(fā)劑、去屑劑、紫外線吸收劑等,既有油包水,也有水包油的配方。從化妝品基質中將80%以上目標物提取出來并凈化,實現準確定量具有挑戰(zhàn)性[103]。因為成千上萬個產品的配方不盡相同,而《規(guī)范》中的檢驗方法在研制時,也不可能考察全部市售產品的基質,這就導致了《規(guī)范》中大多LC方法分析實際樣品時,總是存在干擾。

盡管分析化妝品樣品時采用的前處理方法多樣,但實際工作中,液-液和固-液萃取是化妝品分析中主要的樣品提取方式[104]?！兑?guī)范》中大多數LC采用甲醇提取后直接進樣,甲醇對表面活性劑、增稠劑等也有溶解能力,導致這些組分一同被提取并進入色譜柱,產生不可逆吸附,柱效迅速下降,增加了檢測成本。當用LC測定乳狀化妝品時,濾膜過濾會導致待分析物的損失,然而,若不過濾則很快使色譜柱失效[105]。而CE可將懸浮液直接進樣。即使測定化妝品中鉛、鎘和汞時,也無需復雜的樣品前處理,利用響應函數法并結合膠束電動毛細管色譜法測定個人護理產品中潛在香料致敏原和防腐劑同樣無需樣品前處理,顯示了CE的優(yōu)勢[106]。與原子吸收光譜法的單元素測定相比,CE具有多元素分析的能力,與電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)相比,單樣品檢測的成本相對較低,所需的設備成本也相對較低[107]。此外,ICP-MS還存在傳質效率較低、光譜/非光譜干擾等局限性[106]。CE還用于化妝品中非離子表面活性劑的表征和測定[108]，相對分子質量低(380 kD)和相對分子質量高(2180 kD)的透明質酸(Hyaluronic, HA)混合物[109]的測定,紅藻生物活性的評價[110],香料[111],個人護理產品中三氯生[112],美白劑和對羥基苯甲酸酯[113,114],防腐劑[115-119],紫外線吸收劑[120],異煙酰胺和煙酰胺[121],苯酚、氫醌、熊果苷和曲酸[122],有機酸[123],煙酸[124],糖皮質激素[125],迷迭香酸[126]等的測定。目前文獻報道利用CE檢測化妝品的文獻不如食品的多,但一旦認識到CE分析化妝品的優(yōu)勢,使用者便愛不釋手。

4 消毒產品或日用品中消毒劑有效成分分析

我國自2003年遭遇SARS之后,又相繼遭遇禽流感,直至當今的新型冠狀病毒肺炎,說明病毒性傳染病仍居各種傳染病之首[127]?？共《舅幬锏氖褂靡踩找鎻V泛。但一些抗病毒藥物可能會導致嚴重的不良后果[127,128]。有企業(yè)卻將禁止使用的抗生素、抗真菌藥物、激素和抗病毒藥物等物料,違法添加到消毒和抗抑菌產品中,以增加消毒或抗抑菌效果。此外,消毒產品劑型有膏劑、霜劑、凝膠、水劑等,與藥品的界定比較模糊,消費者不容易甄別[129]。由于消毒產品中違禁藥物的添加未能像食品中非法添加那樣受到重視,故缺乏相應配套檢驗方法?；谏V篩查、質譜確證的原則,我們分別建立了LC[130]和CE[131]同時測定更昔洛韋、阿昔洛韋、噴昔洛韋的方法,陽性樣品用LC-MS/MS方法確證。利巴韋林因親水性強且無特征紫外吸收,難以用LC分析,故我們僅建立了CE的測定方法[132]及陽性樣品的LC-MS/MS確證方法。

消毒劑中允許使用的有效成分種類遠少于化妝品,利用CE檢測消毒劑有效成分的文獻不如化妝品的多,Kulapina等[133]綜述了合成表面活性劑的CE測定方法。消毒劑有效成分使用的極性分子較多,如用于物體表面消毒的季銨鹽、次氯酸鈉[134,135]等,為增加消毒效果,配方中經常使用表面活性劑、高分子聚合物和中藥提取物。監(jiān)督抽檢要求使用國標進行依法檢驗,然而現有消毒劑國標中涉及的檢測方法有滴定法、分光光度法、GC法和LC法。滴定法和分光光度法常因復配成分干擾而難以獲得準確結果[136],GC法適合易揮發(fā)、極性不強的化合物分析,故大多數有效成分的分析只能用LC進行測定,但消毒劑中復配的基質易不可逆地吸附在色譜柱上,使柱效下降。對于無生色官能團的季銨鹽,一般采用通用型檢測器如電導或蒸發(fā)光散射檢測器,易產生干擾,而且電導檢測不能使用梯度洗脫且平衡時間長;蒸發(fā)光散射檢測器分析實際樣品時,線性范圍窄且測定結果不理想。因此有必要彌補國標中消毒劑現有檢測方法在成本、效率、環(huán)保等方面的不足,而CE無疑是首選。我們用文獻方法[137,138]檢測最近幾年監(jiān)督抽檢的樣品時,發(fā)現未如實標識有效成分的現象依然存在。正是由于CE是目前唯一能夠區(qū)分聚六亞甲基雙胍和聚六亞甲基單胍的方法,2016年對GB 26367-2010[139]進行修訂時,將CE方法納入資料性附錄里,新版標準號也相應變?yōu)镚B/T 26367-2020。此外,CE檢測苯扎氯銨的方法也被納入新修訂的GB/T 26369-2020季銨鹽消毒劑衛(wèi)生要求的國家標準。這兩項新修訂的國家標準已于2020年6月2日發(fā)布,將于2021年1月1日正式實施。這兩個CE方法的納入,必將帶動更多的CE方法逐漸進入國家標準。

5 能力驗證

能力驗證可展示實驗室的技術能力,確定新檢測方法的有效性,增加客戶和政府有關部門對實驗室的可信度等。本實驗室2008年利用CE測定了乳及乳制品能力驗證樣品中的三聚氰胺[140],獲得了滿意結果。之后利用文獻方法[141,142],完成了英國弗帕斯實驗室食品分析水平評估(FAPAS)中軟飲料、果醬、肉泥、蔬菜泥、牛奶、糕點等6大類7種食品中咖啡因,可可堿等的13次能力驗證,測試結果Z(標準分數)絕對值均小于2,部分指標的Z值小于0.5,遠遠高于現行的實驗室分析方法。最近,我們利用已建立但未發(fā)表的硝酸鹽和亞硝酸鹽同時分析的CE方法,完成了奶粉、蔬菜泥、肉泥中硝酸鹽和亞硝酸鹽的國內外能力驗證,Z值均小于1;其中萵苣泥、甘藍泥、肉泥和奶粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的電泳圖見圖1。根據樣品含量及基質干擾情況,可裁短并改用內徑50 μm毛細管,以減少分析時間,這也是CE較其余色譜方法的方便靈活之處。所有樣品均加入提取液(將分離緩沖溶液用水稀釋10倍作為提取液)超聲提取30 min,蔬菜泥和肉泥在9 000 r/min離心10 min,上清液直接進樣,奶粉樣品于4 ℃、14 000 r/min離心10 min,上清液過0.45 μm濾膜后進樣,若用60 000 r/min離心,則上清液直接進樣。

圖 1 能力驗證樣品的電泳圖Fig. 1 Electrophoregrams of proficiency test samples CE conditions: running buffer: 90 mmol/L Na3PO4 (without pH adjustment) containing 0.5 mmol/L cetyltrimethylammoniumbromide; sample buffer: 1∶10 dilution of the running buffer; injection pressure: 3448 Pa; detection wavelength: 214 nm; temperature: 25 ℃; capillary: a, d, e. 75 μm×70 cm (effective length 60 cm); b. 50 μm×70 cm (effective length 60 cm); c. 50 μm×50 cm (effective length 40 cm); separation voltage (kV): a. 8; b. 14; c. 10; d. 8; e. 8. Current (μA): a. 93; b. 85; c. 86; d. 93; e. 93. Injection time (s): a. 12; b. 15; c. 10; d. 12; e. 12. Samples: a. lettuce purée; b. cabbage purée; c. meat; d. e. infant formula. Peaks: 1. nitrite; 2. nitrate; 3. chloride.

正是有了上述的技術儲備,我們才能于2016年處置有毒雪碧樣品時,將該法稍作調整,快速排查出次氯酸鈉[143]。說明CE方法的重復性、再現性及其準確定量能力不容置疑。

6 食物中毒事件應急分析

食物中毒事故發(fā)生后,疾控系統(tǒng)的職責就是要快速提供科學、準確的檢測報告,為衛(wèi)生行政部門決策和醫(yī)療機構救治提供技術支撐[144],故檢測報告的準確性及時效性不但體現著疾控機構的業(yè)務能力和技術水平,還體現著政府部門應急反應能力和執(zhí)政能力[145]。食物中毒原因有微生物性、化學性、有毒動植物等,其中常見化學性中毒因子為亞硝酸鹽[146-151]、甲醇[152-156];農藥如涕滅威[157-159]、毒鼠強[160-163]、氟乙酸鈉[164-166]、氟乙酰胺[167],除草劑百草枯[168-171]等。食物中毒樣品種類繁多,毒物含量大部分在成千[146]上百[172]和幾十個mg/kg[157]。LC-MS/MS盡管能快速定性確證待分析物,但需要繁瑣的樣品凈化及同位素內標才能準確定量,不利于快速出具檢測報告。而CE模式多樣、功能強大,開發(fā)快速分離方法,通常只需簡單的樣品制備[173](如血液樣品經稀釋后直接進樣),可彌補LC-MS/MS不能快速定量的不足。這些特點使得CE成為食物中毒應急分析的有力工具。

本實驗室用CE處置了3起食物中毒應急事件,第1起為淀粉中可樂定[145,174],CE在2 h內便給出了定量結果為960 mg/kg[172]。第2起為疑似有毒雪碧樣品,用CE排查出該樣品中含次氯酸鈉或84消毒液[143,175],而LC-MS/MS這個大炮面對次氯酸鈉這個小蚊子,也束手無策,可見CE這個小技術解決了食物中毒應急分析中的關鍵問題。第3起為牛奶[176]及服用者血液中脫氫乙酸。受寧夏回族自治區(qū)疾病預防控制中心委托,我實驗室對其送檢的引起28人發(fā)病的牛奶及中毒者的血液樣品進行檢測。在本實驗室以前的研究基礎上[142],保持毛細管內徑不變,而長度由原70 cm減少至30 cm,以實現對樣品的快速測定,5 min內即可實現樣品分析,完成6份牛奶樣品[177]及9名幼兒服用者血液樣品的分析僅需2 h,為給中毒者進行對癥治療贏得了時間。牛奶中脫氫乙酸含量在1.83～1.95 g/kg,血液中的含量在0.08～0.26 g/kg,血液樣品的電泳圖見圖2。

圖 2 中毒者血液樣品的電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of a blood sample of poisoned patient CE conditions: capillary 50 μm×30.2 cm (effective length 20 cm), separation voltage: 13 kV; injection pressure and time: 3448 Pa for 4 s; detection: 228 nm; temperature: 25 ℃. Peaks: 1. dehydroacetic acid.

上述3起食物中毒事件充分證明了CE成為食物中毒應急分析中不可或缺的有力工具。

7 結論與展望

過去的10年里,CE在疾控系統(tǒng)無論是防病還是衛(wèi)生理化檢驗等方面均有出色表現。

在傳染病控制工作中,基于CE原理的第一代基因測序儀在2020新型冠狀病毒檢測中發(fā)揮了重要作用,顯示CE在核酸測序和片段分析上仍占據重要的一席之地,但是,許多CE的應用都有了對應的分子生物學方法,如Sanger測序與新一代測序、SNP分析與芯片分析、SSCP與高分辨溶解曲線分析等,使CE技術得到了有效的補充。隨著CE-PCR系統(tǒng)的日益發(fā)展,加上擴增反應或預富集步驟,能夠在一次運行中檢測到許多不同的食源性病原微生物。但快速、簡單、經濟、高靈敏度和耐用的食品基質中細菌和病毒檢測仍然是一個發(fā)展方向,但也是挑戰(zhàn)。

食物中毒公共衛(wèi)生事件一般具有突發(fā)性、普遍性、非常規(guī)性及事件規(guī)律難掌握、局勢難控制、本質難判斷、損失難估量的“三性四難”的特征。食物中毒應急分析具有時間緊、任務重、強度大、責任和壓力重等特點。送檢的樣品除基質復雜的食品樣品外,還涉及血樣和尿樣等生物樣品,樣品量一般較少,無法重復采樣。中毒因子中極性小分子較多,科學地選擇檢測技術顯得特別重要。只需簡單樣品制備程序的CE分離模式多、功能強大,非常適合食物中毒的快速應急分析,是CE在疾控領域的特色應用,也是未來疾控領域需要加強的研究方向。

我國吸附無細胞百白破聯合疫苗(DTaP)不良反應發(fā)生率居我國計劃免疫接種的多種疫苗的首位。生物活性極高的納克級內毒素可引起發(fā)熱和其他病理反應,一些相對分子質量小、含量低(nmol/L)的毒素,亦被認為是導致DTaP疫苗不良反應的原因之一,所以疫苗必須嚴格控制內毒素的含量。生物制品的管理控制部門,對各種疫苗的最高內毒素含量均有限制性規(guī)定,并將內毒素含量檢測作為DTaP安全性控制的重要質量標準之一。但快速而準確定量疫苗內毒素的含量一直是挑戰(zhàn),也是疾控領域需努力的方向。

保健食品中免疫球蛋白G(IgG)的國標方法具有成本高、分析時間長和靈敏度不高的缺點,不適合于測定牛奶中IgG。而CE方法盡管成本低、分析時間短,但同樣受限于靈敏度,無法測定牛奶中IgG。利用CE實現乳清蛋白(乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、IgG、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B)的同時分離與測定依然是挑戰(zhàn)。加工食品中花生、蝦、牛奶、雞蛋等主要致敏蛋白定量也受限于檢測靈敏度。未來需開發(fā)新的高效分離體系及靈敏的檢測方法,以期進一步提升蛋白檢測靈敏度,滿足乳品中營養(yǎng)蛋白和致敏源蛋白準確定量的需求。

需求驅動發(fā)展。疾控系統(tǒng)的職責之一是依據標準方法進行常規(guī)檢驗。CE在疾控系統(tǒng)的廣泛應用取決于標準方法納入CE方法的數量。隨著對CE技術潛能認識的逐漸加深,有強烈需求的基層檢驗人員、苦練內功的CE應用研究者和不斷創(chuàng)新的儀器廠家特別是國產廠家的共同推動。CE分析方法納入我國標準體系,必將驅使我國CE技術進入良性循環(huán)的發(fā)展軌道,涌現出更多快速、準確、便捷、靈敏、低成本的方法,有益于基層檢測者,成為解決民生問題的重要技術手段。CE在疾控領域的應用具有廣闊的發(fā)展前景。