劉麗麗, 喬 娟, 張紅醫(yī), 齊 莉*

(1. 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院,北京 100049; 3. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002)

解熱鎮(zhèn)痛藥兼有解熱鎮(zhèn)痛作用,是一類作用于中樞系統(tǒng)的非甾體抗炎藥物,其有效成分包括4-氨基安替比林(4-AA)、氨基比林(AP)、非那西汀(PH)等[1,2],但由于其潛在的副作用,已不再單獨(dú)一味藥使用,因此準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)并控制體液中的解熱鎮(zhèn)痛藥含量對(duì)于疾病的有效治療及藥物的安全使用極其重要。

常用的解熱鎮(zhèn)痛類藥物分離分析方法包括高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及毛細(xì)管電泳法等[1-3]。近年來(lái),基于毛細(xì)管電泳法所呈現(xiàn)的分離效率高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn),人們常用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來(lái)分離分析具有結(jié)構(gòu)相似且呈現(xiàn)中性的藥物[4]。此分離模式雖然可以彌補(bǔ)毛細(xì)管區(qū)帶電泳較難分離中性物質(zhì)的不足,且能顯著改善分離效率,但采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法需要在電泳運(yùn)行緩沖溶液中添加大量的表面活性劑,這不僅會(huì)污染質(zhì)譜離子源,也會(huì)降低被分析物的電離效率及抑制檢測(cè)信號(hào)[5],進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜的聯(lián)用嚴(yán)重受限。

開(kāi)管毛細(xì)管電色譜(OT-CEC)是以管壁涂覆固定相的毛細(xì)管為分離柱,并根據(jù)被分析物與固定相之間的相互作用及其電場(chǎng)中有效電泳淌度的不同而進(jìn)行分離[6,7]。OT-CEC是一種分離中性化合物的有效方法,通過(guò)改變毛細(xì)管表面涂覆的固定相就可改善分離效率和調(diào)控電滲流(EOF)方向[8],如殼聚糖基質(zhì)材料的涂層毛細(xì)管在pH 1.8～12.0范圍內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出兩親性質(zhì),通過(guò)改變OT-CEC緩沖液的pH值至其低于4.5,使涂層毛細(xì)管表面帶正電并基此反轉(zhuǎn)EOF方向[9]; Zhu等[5]合成制備了聚十一烷基硫酸鈉,在毛細(xì)管內(nèi)壁構(gòu)建了聚十一烷基硫酸鈉/聚二烯丙基二甲基氯化銨雙涂層,成功實(shí)現(xiàn)了5種抗癲癇藥物(氯硝安定、氟硝安定等)的OT-CEC分離;Xu等[10]采用開(kāi)環(huán)反應(yīng)將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯鍵合在毛細(xì)管表面并以賴氨酸后修飾該涂層管,發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的OT-CEC體系能極大提高被分析物的分離效率;Tang等[11]在毛細(xì)管表面鍵合了超交聯(lián)聚合物,使用含20%乙腈的5.0 mmol/L硼砂-氫氧化鈉(pH 9.5)作為緩沖溶液并采用OT-CEC策略,成功分離了酮洛芬類藥物;Olsson等[12]將親和素共價(jià)鍵合于毛細(xì)管表面,以含5%(v/v)甲醇的10.0 mmol/L乙酸銨-乙酸(pH 5.8)作為緩沖溶液,開(kāi)展了治療消化道疾病藥物(如奧美拉唑等)的OT-CEC分離分析研究。綜上可知,在OT-CEC體系中不需添加表面活性劑,通過(guò)調(diào)控被分析物與毛細(xì)管涂層固定相之間的相互作用就能改善藥物的OT-CEC分離效率[13-17],也能調(diào)控EOF的方向。但這些已報(bào)道的工作,在聚合物涂層的合成制備中存在操作復(fù)雜、耗時(shí),及為了獲得藥物的OT-CEC高效分離效率需添加有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)[5,11,12]。因此,為解決上述難題,不僅需要發(fā)展兩親性嵌段聚合物的簡(jiǎn)單制備方法,還需要進(jìn)一步以其作為毛細(xì)管涂層來(lái)開(kāi)展解熱鎮(zhèn)痛藥物的綠色OT-CEC分離分析研究。

在本工作中,采用活性/可控自由基可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合方法,合成制備得到了兩親性嵌段聚合物,聚(苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯)(P(St-GMA)),將其涂覆到毛細(xì)管內(nèi)壁,采用乙酸鈉-乙酸作為電泳運(yùn)行緩沖液(不需添加任何有機(jī)溶劑和表面活性劑),構(gòu)建了解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC分離分析新體系,還探討了嵌段聚合物的聚合時(shí)間、涂層聚合物濃度及緩沖液pH等因素對(duì)P(St-GMA)自組裝行為及對(duì)解熱鎮(zhèn)痛藥物OT-CEC分離度(Rs)及遷移時(shí)間的影響,成功實(shí)現(xiàn)了血樣中3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的快速高效分離,為設(shè)計(jì)制備更多功能性嵌段聚合物及其在藥物OT-CEC中的綠色分析應(yīng)用研究提供了新思路和新啟示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

CL1020毛細(xì)管電泳分析儀、254 nm紫外檢測(cè)器(華陽(yáng)利民有限公司,中國(guó));石英玻璃毛細(xì)管(75 μm (i.d.)×60.0 cm(總長(zhǎng))×50.0 cm(有效長(zhǎng)))(河北永年銳灃色譜器件有限公司,中國(guó)); HW-2000色譜工作站(南京千譜軟件有限公司,中國(guó)); Milli-Q純水儀(Millipore公司,美國(guó))。

4-AA(疏水常數(shù)logP=0.81)、AP(logP=0.99)購(gòu)自Acros公司(美國(guó)); PH(logP=1.58)購(gòu)自上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;GMA、偶氮二異丁腈(AIBN)、St和二硫代苯甲酸芐酯(BDTB)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó));N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、硫脲、乙酸鈉(NaAc)、乙酸銨(NH4Ac)、乙酸(HAc)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮及其他試劑均為分析純。SD大鼠血清樣品由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 嵌段聚合物涂層管的制備

采用RAFT聚合法,以St及GMA為單體、AIBN為引發(fā)劑、BDTB為鏈轉(zhuǎn)移劑合成了嵌段聚合物P(St-GMA),具體操作步驟如文獻(xiàn)[14,15]所述。通過(guò)凝膠滲透色譜(GPC)分析,獲知P(St-GMA)的相對(duì)分子質(zhì)量為18.8 kDa。

裸毛細(xì)管分別用1.0 mol/L NaOH溶液、純水及甲醇各清洗10 min后,3 h內(nèi)將1.0 mL含50.0 mg/mL P(St-GMA)的DMF溶液慢速流經(jīng)毛細(xì)管,聚合物涂層管于25 ℃干燥12 h后,再放入50 ℃烘箱中烘干2 d,備用。

1.3 樣品前處理

用緩沖液配制3種藥物(0.2 mg/L)的儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱保存,備用。取60.0 μL鼠血清樣品與200.0 μL乙腈混合,于25 ℃離心20 min(12 000 r/min)[18];取上清液,用N2吹干,于-18 ℃冰箱中冷藏保存,備用。以2.0 mg/mL硫脲作為考察EOF的標(biāo)記物。

1.4 分析條件

進(jìn)樣前,涂層毛細(xì)管用純水及緩沖溶液各沖洗10 min,樣品通過(guò)高差方式進(jìn)樣(15.0 cm, 8 s)。OT-CEC分離電壓為+15.0 kV,電泳緩沖液為50.0 mmol/L NaAc-HAc (pH 5.7), 0.45 μm濾膜過(guò)濾,備用。Rs1為AP與4-AA之間的分離度;Rs2為4-AA與PH之間的分離度。

圖 1 (a)P(St-GMA)的FT-IR圖譜和(b)裸毛細(xì)管及(c、d)涂層毛細(xì)管的SEM圖Fig. 1 (a) FT-IR of P(St-GMA) and SEM images of (b) bare capillary and (c, d) coated capillaryP(St-GMA): poly(styrene-co-glycidyl methacrylate); SEM: scanning electronic microscopy.

2 結(jié)果與討論

2.1 嵌段聚合物涂層管的制備及表征

P(St-GMA)的傅里葉變換紅外光譜(見(jiàn)圖1a)展示了苯環(huán)上有-CH2-振動(dòng)吸收特征峰(2 922 cm-1)、C=O振動(dòng)吸收特征峰(1 600 cm-1和1 732 cm-1)、C=C雙鍵特征吸收峰(1 450 cm-1和1 492 cm-1)及C-H的面外彎曲振動(dòng)吸收峰(698 cm-1)[14],表明嵌段聚合物合成成功。從掃描電子顯微鏡(SEM)圖中可觀察到在毛細(xì)管內(nèi)壁形成了明顯與裸毛細(xì)管(見(jiàn)圖1b)不同的涂層表面(見(jiàn)圖1c和圖1d),表明涂層毛細(xì)管已成功制備。

裸毛細(xì)管的EOF值為5.6×10-4cm2/(V·s),嵌段聚合物涂層管的EOF值為4.0×10-4cm2/(V·s)。結(jié)果表明:涂層管可有效抑制EOF,并會(huì)影響被分析物的OT-CEC分離度及其遷移時(shí)間。連續(xù)進(jìn)樣10次測(cè)定EOF值,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<2.0%,表明該涂層管具有良好的穩(wěn)定性。

圖 2 (a)聚合時(shí)間、(b)聚合物含量、(c)緩沖溶液種類、(d)有機(jī)溶劑添加劑、(e)緩沖液pH值、(f)NaAc濃度對(duì)藥物OT-CEC分離度的影響和(g)緩沖液pH和(h)NaAc濃度對(duì)涂層管EOF的影響(n=3)Fig. 2 Effect of (a) polymerization time, (b) contents of P(St-GMA), (c) buffer types, (d) organic solvent additives,(e) pH values of buffer, (f) concentrations of NaAc on the resolutions (Rs) and (g) pH values of buffer and (h) concentrations of NaAc on the electroosmotic flow (EOF) of coated capillary (n=3) Rs1: resolution between antipyrine (AP) and 4-aminoantipyrine (4-AA); Rs2: resolution between 4-AA and phenacetin (PH); Buffer 1: K2HPO4-NaH2PO4; Buffer 2: NH4Ac-HAc; Buffer 3: NaAc-HAc; ACN: acetonitrile; MeOH: methanol; DMK: acetone; EtOH: ethanol.

2.2 OT-CEC分離條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)首先考察了不同聚合時(shí)間所制備的P(St-GMA)對(duì)3種解熱鎮(zhèn)痛藥物Rs的影響。如圖2a顯示,使用聚合時(shí)間為3 h的涂層管時(shí),這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的遷移時(shí)間<10 min,但4-AA與AP不能基線分離(Rs1<1.5),而增加聚合時(shí)間可顯著提升藥物的OT-CEC分離度(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但當(dāng)聚合時(shí)間從3 h增加至24 h時(shí),這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC遷移時(shí)間也隨之延長(zhǎng)至23 min。隨著P(St-GMA)含量從30.0 mg/mL升高至70.0 mg/mL,被分析物與聚合物涂層之間的相互作用亦隨之增強(qiáng),并顯著改善了這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC分離度(見(jiàn)圖2b),但被分析物的遷移時(shí)間亦從<10 min延長(zhǎng)至40 min。綜合考慮,能在最短的遷移時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳分離的目的,最終選擇12 h為最佳聚合時(shí)間,并以50.0 mg/mL聚合物涂覆的毛細(xì)管來(lái)開(kāi)展后續(xù)的OT-CEC分離分析研究。

其次,實(shí)驗(yàn)考察了3種不同的緩沖液對(duì)解熱鎮(zhèn)痛藥物分離度的影響(見(jiàn)圖2c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以K2HPO4-NaH2PO4作為OT-CEC的緩沖溶液時(shí),4-AA與PH不能基線分離(Rs2<1.5);采用NH4Ac-HAc和NaAc-HAc作為緩沖溶液時(shí),雖然可實(shí)現(xiàn)被測(cè)藥物的基線分離(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但以NH4Ac-HAc為緩沖溶液時(shí),這3種藥物的遷移時(shí)間(20 min)要長(zhǎng)于以NaAc-HAc為緩沖溶液的分析體系(12 min)。依據(jù)有機(jī)溶劑極性的不同,進(jìn)一步考察了4種常用有機(jī)溶劑[17]對(duì)被測(cè)藥物OT-CEC分離度及遷移時(shí)間的影響。如圖2d所示,當(dāng)在NaAc-HAc緩沖液中添加15.0%(v/v)丙酮時(shí),4-AA與PH完全不能分離;而以添加了15.0%(v/v)乙腈、15.0%(v/v)甲醇及15.0%(v/v)乙醇的NaAc-HAc作為緩沖溶液,均能實(shí)現(xiàn)這3種藥物的基線分離(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但它們的遷移時(shí)間卻從不含有機(jī)溶劑體系的12 min大幅延長(zhǎng)至25 min。結(jié)果表明:乙腈、甲醇及乙醇這3種有機(jī)溶劑添加劑有利于嵌段聚合物在溶液中形成膠束結(jié)構(gòu)[17],并能顯著增加被分析物的分離度,但會(huì)導(dǎo)致其遷移時(shí)間大幅延長(zhǎng)。為實(shí)現(xiàn)高效、快速及綠色分離,最終以不添加任何有機(jī)溶劑的NaAc-HAc為緩沖溶液來(lái)開(kāi)展解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC分離分析研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10,12],緩沖液pH對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁的電荷分布及被分析物的分離效率有顯著影響。由于解熱鎮(zhèn)痛藥物的pKa值接近5.0[19],因此實(shí)驗(yàn)考察了不同緩沖液pH值(5.5～6.8)對(duì)解熱鎮(zhèn)痛藥物分離度及遷移時(shí)間的影響[12,19]。如圖2e顯示,在緩沖液pH為5.5～6.0時(shí),3種被分析物均可實(shí)現(xiàn)OT-CEC基線分離(Rs1>1.5、Rs2>1.5),而pH為5.7時(shí),藥物的遷移時(shí)間最短,這要?dú)w功于藥物在低pH緩沖液中的部分解離及其與聚合物膠束的相互作用;而當(dāng)緩沖液pH值增加至6.8時(shí),被分析物的遷移時(shí)間略微減小(<10 min),但只能部分分離AP與4-AA(Rs1<1.5),且完全不能分離4-AA與PH(Rs2=0)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了緩沖液中NaAc的濃度(10.0～70.0 mmol/L)對(duì)藥物分離度的影響(見(jiàn)圖2f)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)NaAc濃度從10.0 mmol/L增至30.0 mmol/L時(shí),被分析物的Rs明顯增加;當(dāng)其濃度從30.0 mmol/L繼續(xù)增至70.0 mmol/L時(shí),藥物的遷移時(shí)間從14 min大幅縮短至<10 min,而4-AA與PH的分離度在50.0 mmol/L NaAc緩沖液中達(dá)到最大值(Rs2=2.3)。基此,為在最短的遷移時(shí)間內(nèi)獲得最佳Rs值,最終選擇了50.0 mmol/L NaAc-HAc(pH 5.7)進(jìn)行后續(xù)OT-CEC研究。

圖 3 3種藥物的(a)裸管毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖、(b)裸管膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜圖和(c)OT-CEC譜圖Fig. 3 (a) Bare tube capillary zone electrophoresis, (b) bare tube micelle electrokinetic capillary chromatogram and (c) OT-CEC electropherogram of the three drugs1. AP (100.0 μmol/L); 2. 4-AA (100.0 μmol/L); 3. PH (80.0 μmol/L).

如圖2g及圖2h顯示,緩沖液pH(5.5～6.8)及NaAc濃度(10.0～70.0 mmol/L)的改變僅對(duì)涂層管的EOF值產(chǎn)生微小的影響,表明該涂層管具有良好的EOF抑制效果,因此,被分析物的OT-CEC分離度及其遷移時(shí)間主要取決于其與涂層管表面的嵌段聚合物的相互作用力(包括親疏水作用及氫鍵作用)。

2.3 OT-CEC分離機(jī)理

如圖3a顯示,使用裸毛細(xì)管以毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離模式不能實(shí)現(xiàn)這3種藥物的良好分離;在緩沖液中添加了50.0 mmol/L表面活性劑SDBS,以裸管膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分離模式可實(shí)現(xiàn)被分析物的基線分離(見(jiàn)圖3b);而在緩沖液中不添加SDBS及有機(jī)溶劑添加劑,采用OT-CEC分離模式,可基線分離這3種被分析物(Rs1=3.8、Rs2=2.3)(見(jiàn)圖3c)。值得一提的是,這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC遷移順序與膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜的遷移順序相反。與毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離模式(見(jiàn)圖3a)及膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分離模式相比(見(jiàn)圖3b),雖然被分析物PH出現(xiàn)了峰拖尾現(xiàn)象(見(jiàn)圖3c),但其OT-CEC遷移順序卻與藥物的疏水特性(logPAP=0.99、logP4-AA=0.81、logPPH=1.58)基本吻合,基此推測(cè):PH同嵌段聚合物涂層之間的較強(qiáng)疏水相互作用[20]是導(dǎo)致此峰展寬的主因。

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果及藥物的遷移順序推測(cè),涂層管中的嵌段聚合物可以起到“類表面活性劑”的作用[17],其OT-CEC的分離機(jī)理見(jiàn)圖4。P(St-GMA)具有兩親性,其中的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)嵌段部分具有親水性,而聚苯乙烯(PSt)嵌段部分具有強(qiáng)烈的疏水性。在水溶液中,P(St-GMA)易于發(fā)生自組裝并形成類表面活性劑膠團(tuán)結(jié)構(gòu)。在電場(chǎng)力作用下,由于被分析物的有效電泳淌度不同,其與聚合物類表面活性劑膠團(tuán)的相互作用(包括親疏水作用及氫鍵作用)強(qiáng)弱不同,使得各自的遷移時(shí)間不同,最終實(shí)現(xiàn)這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的高效分離。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

以解熱鎮(zhèn)痛藥物的峰面積為縱軸(y, μV·s),以其濃度為橫軸(x, μmol/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.995(見(jiàn)表1)。方法的檢出限(LOD)通過(guò)3倍信噪比(S/N=3)來(lái)確定。被分析物在涂層管的日內(nèi)、日間和柱間的遷移時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.27%～3.46%(n=3)。結(jié)果表明:該聚合物涂層管具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性,所發(fā)展的OT-CEC分析方法可用于解熱鎮(zhèn)痛藥物的定量分析。

圖 4 基于P(St-GMA)涂層與藥物相互作用的OT-CEC分離機(jī)理示意圖Fig. 4 Mechanism illustration for OT-CEC analysis based on the interaction between P(St-GMA) coating and the drugs

表 1 3種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

進(jìn)一步將所構(gòu)建的OT-CEC方法用于鼠血清空白樣品(見(jiàn)圖5a)及添加了藥物的血清樣品的分離分析(見(jiàn)圖5b)。血清樣品在添加解熱鎮(zhèn)痛藥物后回收率為97.0%～104.1%(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明:所建OT-CEC分析方法可用于實(shí)際血清樣品中解熱鎮(zhèn)痛藥物的定量分析。

圖 5 (a)血清空白樣品和(b)加標(biāo)血清樣品的OT-CEC譜圖Fig. 5 OT-CEC electropherograms of (a) the blank serum and spiked serum sample 1. AP (100.0 μmol/L); 2. 4-AA (100.0 μmol/L); 3. PH (80.0 μmol/L).

表 2 血清樣品中3種藥物的回收率(n=3)

3 結(jié)論

以所設(shè)計(jì)及合成制備的兩親性嵌段聚合物P(St-GMA)為毛細(xì)管涂層,以NaAc-HAc為緩沖液,構(gòu)建了新型OT-CEC分析體系,實(shí)現(xiàn)了3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的基線分離。嵌段聚合物P(St-GMA)在溶液中發(fā)生自組裝形成類表面活性劑膠團(tuán)結(jié)構(gòu),顯著提高了解熱鎮(zhèn)痛藥物的分離度,還避免了使用有機(jī)溶劑所造成的環(huán)境污染。所建立的OT-CEC方法展現(xiàn)了其可通過(guò)調(diào)控被分析物與嵌段聚合物涂層之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)高效分離的特點(diǎn),這將有助于OT-CEC在實(shí)際血樣中藥物的分析應(yīng)用。