霍好利

缺血性腦卒中是導(dǎo)致血管性癡呆的主要病因，而學(xué)習(xí)記憶功能障礙是其早期的主要臨床表現(xiàn)[1,2]。銀杏二萜內(nèi)酯類主要來自于銀杏葉，其銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(diterpene ginkgolides meglumine injection，DGMI)主要是由銀杏內(nèi)酯組成，研究發(fā)現(xiàn)DGMI能夠抑制氧化應(yīng)激和抑制體內(nèi)的細(xì)胞凋亡[3-6]，但其是否可以改善患者腦缺血后的學(xué)習(xí)記憶能力尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將復(fù)制腦缺血大鼠模型并行DGMI治療，從而研究DGMI對患者腦缺血后的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買健康清潔級(jí)的雄性SD大鼠(8周齡，體重220～260 g，動(dòng)物合格證號(hào)：201809014)。大鼠飼養(yǎng)溫度23℃～25℃，飼養(yǎng)環(huán)境的相對濕度為55%～60%，飼養(yǎng)光照的周期為12 h∶12 h，大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且手術(shù)前需常規(guī)24 h禁食，可以自由飲水。

1.2 藥物與試劑 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的DGMI(規(guī)格：25 mg∶5 ml，批號(hào)：20170416)；北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TUNEL試劑盒(批號(hào)：170417)；上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Bcl-2抗體(批號(hào)：071209)、Bax抗體(批號(hào)：180113)和ABC-DAB(批號(hào)：180107)等試劑盒；南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：20170404)、過氧化氫酶(CAT，批號(hào)：20170513)、丙二醛(MDA，批號(hào)：20170124)等試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；采用北京麥克奧迪儀器儀表有限公司生產(chǎn)的Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)；L-80XP型低溫超速離心機(jī)(美國Beckman公司)；FSH-Ⅱ型勻漿器(江蘇金壇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.4 分組、模型制備與給藥 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字法將200只實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組100例。按照DGMI劑量分為低(劑量1.5 mg·kg-1·d-1)、中(劑量3 mg·kg-1·d-1)、高(劑量6 mg·kg-1·d-1)劑量組，每組40只。根據(jù)王釗楠等[7]實(shí)驗(yàn)報(bào)道，制備慢性腦缺血大鼠模型需采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法，但是假手術(shù)組僅需游離頸總動(dòng)脈不進(jìn)行結(jié)扎。精確稱取DGMI，加入適量0.9%氯化鈉溶液配置濃度為0.75 mg/ml的DGMI溶液，然后加入0.9%氯化鈉溶液依次配置濃度為1.5 mg/ml、3 mg/ml的DGMI溶液，各組均于術(shù)后第2天開始腹腔注射給藥治療(2 ml/kg)，療程14 d，假手術(shù)組和模型組同步腹腔注射給予等體積的0.9%氯化鈉溶液(2 ml/kg)。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

1.5.1 水迷宮實(shí)驗(yàn):將Morris水迷宮裝置(直徑1.3 m、深度0.5 m)置于暗室，添加適量水并設(shè)置恒溫25℃水溫，將圓形水面按十字法劃分為4個(gè)象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，于第Ⅲ象限水面下2 cm設(shè)置直徑10 cm、高30 cm的安全平臺(tái)，安置攝像機(jī)記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。①定位航行試驗(yàn)：正式試驗(yàn)前1 d，每只大鼠均適應(yīng)性訓(xùn)練120 s；將大鼠分別在4個(gè)象限面放入水迷宮的池壁中，然后記錄大鼠2 min內(nèi)游泳的軌跡和逃避潛伏的時(shí)間，大鼠到達(dá)安全平臺(tái)后需停留30 s，如果大鼠2 min 內(nèi)未找到安全平臺(tái)，就將大鼠的逃避潛伏期記為120 s，每只大鼠均連續(xù)進(jìn)行5 d、取平均值。②空間探索試驗(yàn)：在定位航行試驗(yàn)結(jié)束后的第2天，將安全平臺(tái)撤去，把所有大鼠放入第Ⅱ象限面，然后觀察和記錄90 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)在原來設(shè)置安全平臺(tái)的次數(shù)。

1.5.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn):每組隨機(jī)抽取10只大鼠，正式試驗(yàn)前1 d放在平臺(tái)后接通電源，適應(yīng)性訓(xùn)練180 s；正式試驗(yàn)時(shí)，大鼠就直接放在接通銅柵電源的平臺(tái)上，然后記錄大鼠3 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)和承受電擊的總時(shí)間。

1.6 大腦海馬CA1區(qū)行病理學(xué)檢查 每組均隨機(jī)抽取10只大鼠，在大鼠深度麻醉后進(jìn)行斷頭取腦，并將嗅球、小腦和低位腦干去除，采用濃度為4%的多聚甲醛溶液固定3 d，進(jìn)行石蠟包埋、切片和脫蠟水化等操作，再進(jìn)行常規(guī)HE染色(先用乙醇梯度進(jìn)行脫蠟、PBS洗滌，再用蘇木素進(jìn)行5 min染色，之后用濃度為0.5%的乙醇鹽酸進(jìn)行分色、采用尹紅染色20 s等)，染色后再利用倒置光學(xué)顯微鏡去觀察實(shí)驗(yàn)大鼠大腦海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)。

1.7 TUNEL染色法觀察大腦海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡狀況 取1.5制備的腦組織切片，經(jīng)乙醇梯度脫蠟水化處理后，按照TUNEL試劑盒步驟進(jìn)行染色(細(xì)胞核黃褐色著色為陽性著色)。凋亡指數(shù)(AI)計(jì)算：顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，AI(%)=(視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)/視野中的細(xì)胞總數(shù))×100%，每只大鼠均取5張切片，每張切片需選取5個(gè)互不重疊視野取平均值。

1.8 IHC法檢測大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取1.5制備的組織石蠟切片，經(jīng)乙醇梯度脫蠟水化處理后，按照Bcl-2、Bax試劑盒操作步驟，采用ABC-DAB法進(jìn)行IHC操作[依次進(jìn)行3% H2O2-甲醇溶液孵育25 min、血清封閉1.5 h、一抗(1∶500)4℃過夜、二抗(1∶200)室溫孵育1.5 h、DAB顯色5 min等]，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察(黃褐色為陽性著色)。每只大鼠取5張切片，每張切片取5個(gè)互不重疊的視野，通過Image Pro plus圖像分析系統(tǒng)測定圖片灰度，進(jìn)行半定量分析。

1.9 比色法測定大腦海馬區(qū)的抗氧化酶的活性與MDA的含量 將每組剩余10只大鼠進(jìn)行麻醉，然后斷頭取腦，將海馬組織剝?nèi)『笱心驖{，在3 000 r/min的低溫(4℃)下進(jìn)行離心，15 min后取上清液，然后按照步驟處理，再用紫外-可見分光光度計(jì)來測定抗氧化酶的活性和MDA的含量情況。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力測定結(jié)果 (1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期和逃避路程均顯著增長(P<0.01)；而腦缺血大鼠在DGMI中、高劑量治療2周后能降低逃避潛伏期和縮短逃避的路程，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。模型組大鼠穿越原設(shè)安全平臺(tái)位置的次數(shù)少于假手術(shù)組大鼠(P<0.01)；腦缺血大鼠采用DGMI中、高劑量治療2周后穿越原平臺(tái)位置次數(shù)高于模型組大鼠(P<0.05或P<0.01)。(2)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多且受電擊總時(shí)間顯著延長(P<0.01)；而與模型組比較，腦缺血大鼠經(jīng)DGMI中、高劑量治療14 d后犯錯(cuò)誤次數(shù)減少且受電擊時(shí)間縮短(P<0.05或P<0.01)。見表1、2。

表1 5組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 5組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 大腦海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，而模型組大鼠海馬CA1區(qū)則呈現(xiàn)明顯的病理性改變，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的層次紊亂、神經(jīng)元數(shù)量減少且細(xì)胞間隙呈增大趨勢，膠質(zhì)細(xì)胞也有所增加，胞核固縮或是溶解，核仁消失；與模型組比較，經(jīng)DGM治療14 d能夠明顯改善腦缺血大鼠大腦海馬CA1區(qū)組織形態(tài)和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)病變，其中DGMI高劑量組上述效果最為顯著。見圖1。

圖1 5組大腦海馬CA1區(qū)病理學(xué)檢查結(jié)果(HE×400);A 假手術(shù)組；B 模型組；C DGMI低劑量組；D DGMI中劑量組；E DGMI劑量組

2.3 大鼠大腦海馬CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡結(jié)果觀察 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞(經(jīng)TUNEL染色陽性著色：凋亡的細(xì)胞核呈黃褐色)數(shù)量明顯高于假手術(shù)組；而與模型組比較，經(jīng)DGM治療14 d后腦缺血大鼠大腦海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，DGMI劑量組減少效果最為顯著。模型組大鼠與假手術(shù)組大鼠大腦海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比較，呈顯著升高趨勢[(65.03±8.71)%vs(2.69±1.08)%，P<0.01]，而與模型組比較，DGMI中、高劑量組AI顯著降低[(40.92±6.75)%、(16.94±3.37)% vs(65.03±8.71)%，P<0.01]。見圖2。

圖2 5組大鼠大腦海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL×400);A 假手術(shù)組；B 模型組；C DGMI低劑量組；D DGMI中劑量組；E DGMI劑量組

2.4 大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測結(jié)果 細(xì)胞質(zhì)通過Bcl-2蛋白和Bax蛋白進(jìn)行表達(dá)；模型組大鼠與假手術(shù)組大鼠比較，大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)和灰度值降低(P<0.01)，與假手術(shù)組大鼠比較Bax蛋白表達(dá)上調(diào)和灰度值升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax值顯著降低(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)DGMI中、高劑量治療14 d后腦缺血大鼠大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)、Bax表達(dá)下調(diào)，灰度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2/Bax值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、4，表3。

圖3 5組大鼠大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)(IHC×400);A 假手術(shù)組；B 模型組；C DGMI低劑量組；D DGMI中劑量組；E DGMI劑量組

圖4 5組大鼠大腦海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達(dá)(IHC×400);A 假手術(shù)組；B 模型組；C DGMI低劑量組；D DGMI中劑量組；E DGMI劑量組

表3 5組大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)灰度值及Bcl-2/Bax值

2.5 5組抗氧化酶的活性和MDA含量比較 模型組大鼠大腦海馬區(qū)的抗氧化酶活性比假手術(shù)組低，且MDA含量呈升高趨勢(P<0.01)；經(jīng)DGMI中、高劑量治療14 d的大鼠比模型組大鼠的抗氧化酶(SOD、CAT)活性高，還有助于降低MDA的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 5組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量

3 討論

血管性癡呆(VD)是缺血性腦卒中后常見的神經(jīng)功能障礙并發(fā)癥[8,9]，其中學(xué)習(xí)記憶能力降低是其最主要的早期臨床表現(xiàn)[1,2]。隨著老齡化的加劇、腦血管疾病發(fā)病率的上升，VD患病人群也逐年增多[10]。目前，臨床上主要采取抗凝溶栓、改善腦循環(huán)等治療方案，但對于VD的防治作用并不理想，仍是臨床上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是評價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力的常用實(shí)驗(yàn)方法，能夠較好地反映空間學(xué)習(xí)記憶的形成和維持并且能夠量化[11,12]，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI治療能夠有效縮短腦缺血大鼠逃避潛伏期和跳臺(tái)潛伏期、增加跳臺(tái)次數(shù)，提示DGMI對腦缺血所致學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有一定的改善作用。

空間學(xué)習(xí)記憶與大腦海馬區(qū)密切相關(guān)，其中海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞是形成記憶的重要區(qū)域[13]。海馬CA1區(qū)對錐體細(xì)胞缺血缺氧非常敏感，因此腦缺血極容易導(dǎo)致CA1區(qū)錐體細(xì)胞損傷而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低[14]。既往病理學(xué)研究證明，患者出現(xiàn)腦缺血，會(huì)引起海馬區(qū)的神經(jīng)功能受損，還會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)繼發(fā)性凋亡，如果及時(shí)挽救患者缺血的半影區(qū)神經(jīng)元，就能抑制患者出現(xiàn)缺血性腦損傷[15]。Bcl-2、Bax蛋白在對于細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用非常重要，二者同源但工作相反[16]，Bcl-2表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的生理作用，而Bax具有促凋亡的生理作用，并且Bcl-2和Bax能夠形成二聚體而雙雙失活，因此Bcl-2/Bax值更加能夠體現(xiàn)二者在細(xì)胞凋亡過程中所表現(xiàn)出的實(shí)際作用[17]。大鼠出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷主要是因?yàn)榇笫篌w內(nèi)的氧自由基出現(xiàn)代謝失衡導(dǎo)致的，而清除體內(nèi)氧自由基取決于SOD和CAT等關(guān)鍵還原酶[18]，MDA是大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，所以能夠間接反應(yīng)大鼠的胰腺組織氧化應(yīng)激損傷程度的就是胰腺組織的SOD、CAT的活性和MDA的含量[19]。結(jié)果顯示，大鼠采用DGMI治療可以顯著抑制腦缺血大鼠大腦海馬CA1區(qū)組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)病變、抑制海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡，使海馬CA1區(qū)的Bcl-2表達(dá)上調(diào)， Bax表達(dá)下調(diào)，有助于使Bcl-2/Bax值提高，能使大腦海馬區(qū)的抗氧化酶活性得到改善，還能使MDA含量得以降低，結(jié)果提示腦缺血后采用DGMI治療能改善其學(xué)習(xí)的記憶能力，這是因?yàn)镈GMI抑制大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變及該部位細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，DGMI具有改善腦缺血所致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，這是因?yàn)镈GMI能夠調(diào)控體內(nèi)相關(guān)基因(Bcl-2、Bax)的表達(dá)，有助于減少氧化應(yīng)激造成的損傷，與其能抑制大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變及該部位細(xì)胞凋亡有關(guān)。