閆歡　高芬　王夢亮　秦雪梅

摘要 通過分析黃芪根腐病病株和健株根圍微生物菌群的變化， 探究根腐病的發(fā)病機理， 尋找預警病害發(fā)生的生物指示因子， 為土壤微生態(tài)的生物調(diào)控提供依據(jù)。試驗通過菌落計數(shù)、PCR-DGGE和16S rRNA V3區(qū)基因測序的方法， 分析不同年限下黃芪根圍病/健土中微生物區(qū)系、多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：細菌作為黃芪根圍土中的優(yōu)勢種群，是影響病土中微生物數(shù)量升高的關(guān)鍵因子， 其多樣性降低是影響病害加重的主要原因之一。假單胞菌屬Pseudomonas和無色桿菌屬Achromobacter為土壤中的優(yōu)勢菌群， 健土中的1號和4號特異條帶分別為未培養(yǎng)的假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.和熒光假單胞菌P.fluorescens;6號未培養(yǎng)假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.的豐度與根腐病發(fā)病率負相關(guān)，16號無色桿菌Achromobacter sp. 的豐度則在3年生土壤中顯著升高，隨后急劇下降。上述4個菌可作為潛在的土壤健康或發(fā)病指示因子進一步研究。

關(guān)鍵詞 黃芪; 根腐病; 微生物區(qū)系; 細菌多樣性; 群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S 435.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019184

Changes of microbial community in root zone soil of Astragalus membranaceus suffering from root rot disease

YAN Huan2，3#， GAO Fen1#， WANG Mengliang1， QIN Xuemei3*

（1. Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006，China; 2. College of Chemistry and

Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China; 3. Modern Research Center for Traditional

Chinese Medicine， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract

By analyzing the changes of microbial community in root zone soil of Astragalus membranaceus diseased and healthy plants， the study aimed at exploring the pathogenesis mechanism and biological warning indicators for the root rot disease occurrence so as to provide a theoretical basis for the biological regulation of soil micro-ecology. The microbial community in the diseased and healthy soil samples was examined through plate colony counting， PCR-DGGE and 16S rRNA V3 gene sequencing to probe into the changes of the microflora， microbial diversity and community structure in different planting years. The results showed that bacteria， as the dominant flora in the soil， were a key factor resulting in significant increase of microorganism quantity in diseased soils. The significant decrease in the bacterial diversity was one of the main causes for the increase of root rot disease incidence. Pseudomonas and Achromobacter were the dominant genera in the root zone soil. The specific bands No.1 and No.4 in the healthy soil were Uncultured Pseudomonas sp. and P. fluorescens， respectively; the abundance of No.6 Uncultured Pseudomonas sp. was negatively correlated with the root rot incidence， and No.16 Achromobacter sp. increased remarkably at the 3rd year and then began to decrease sharply. The four strains were worth further study as the potential biological indicator of soil health and disease occurrence in the future.

Key words

Astragalus membranaceus; root rot disease; microflora; bacterial diversity; community structure

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus （Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，具有提高免疫力、保護肝臟、滋養(yǎng)補益、利尿消腫、抗糖尿病等多種藥理功效，以其為原料的中成藥多達200余種，是中醫(yī)藥學公認的道地大宗藥材和保健品原料[1]，素有“十藥八芪”之稱。根腐病作為一類毀滅性的土傳病害，近年來在黃芪種植中發(fā)生逐年加重。山西作為道地黃芪的重要產(chǎn)區(qū)，一般移栽黃芪田塊的發(fā)病率為10%～30%，重者高達60%，3年或3年以上植株發(fā)病更為嚴重[2]，這對黃芪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了嚴重影響。目前，引起山西黃芪根腐病的致病菌已基本明確，包括銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatum、腐皮鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、芬芳鐮刀菌F.redolens、鏈格孢菌Alternaria sp. 以及Ilyonectria torresensis，其中銳頂鐮刀菌和腐皮鐮刀菌為優(yōu)勢致病菌[3]。對于該病害的防治，生產(chǎn)上最常用的方法是化學防治，但病菌抗藥性的產(chǎn)生，以及化學農(nóng)藥高毒高殘留的特性，使得防治效果并不理想，并且對黃芪的臨床安全性產(chǎn)生了很大的負面影響，而傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治措施受限因素多、成本高，實施非常困難。基于此，亟待發(fā)展新的有效防治措施。近年來，生物調(diào)控和生物防治因其綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢日益受到人們重視。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生態(tài)特別是根際微生物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)失調(diào)與土傳病害發(fā)生有很大關(guān)聯(lián)[4]。通常土傳病害發(fā)病土壤的微生物區(qū)系與健康土壤明顯不同。如三七病株根際土和根系土中細菌數(shù)目的大量增加是急性青枯型根腐病最明顯的特征[5]，而丹參紅葉病病株根區(qū)土細菌數(shù)量較健株減少41.3%，真菌和放線菌數(shù)量分別較健株增加156.6%和189.5%[6]。為了明確病/健土中差異性微生物類群發(fā)生了怎樣的變化，科研人員通過分析其多樣性來更清晰地反映土壤中微生物的動態(tài)。Wang 等[7]對煙草青枯病的研究發(fā)現(xiàn)，與感病土壤相比，健康土壤表現(xiàn)出更高的細菌多樣性，但Wu等[8]卻發(fā)現(xiàn)對香草枯萎病的抑制性與較高的真菌多樣性和較低的細菌多樣性有關(guān)?？梢娢⑸锒鄻有允峭寥澜】档囊粋€指標，但哪類微生物的多樣性起主導作用卻隨植物和病害的不同而不同。進一步研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化也會對植物土傳病害產(chǎn)生明顯影響[9]，且從該角度切入還可以尋找到有效的土壤抑病或感病指示因子。如陸曉菊等[10]發(fā)現(xiàn)伯克氏菌屬Burkholderia，芽胞桿菌屬Bacillus，鏈霉菌屬Streptomyces等細菌是三七健康土壤中的優(yōu)勢種群。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)苜蓿莖點霉Phoma medicaginis和P.pinodella的豐度與豆科植物根腐病的病情指數(shù)正相關(guān)，而柄孢殼菌Podospora spp.、Pseudaleuria spp.和Veronaea spp.的豐度與病情指數(shù)負相關(guān)，這表明上述真菌與豆科植物根部病害的發(fā)生關(guān)系密切，是潛在的土壤生物指示因子。借助這些指示菌株不僅可以評價土壤健康狀況、預測病害的發(fā)生，同時也可為病害的生物調(diào)控提供依據(jù)。但針對黃芪根腐病的相關(guān)研究目前還未見報道。

本研究采集1～6年的健康和發(fā)病黃芪根圍土壤樣品，通過菌落計數(shù)、PCR-DGGE和16S rRNA V3區(qū)基因測序的方法，分析比較黃芪根圍病土和健土之間微生物菌群的變化，旨在從土壤微生態(tài)的角度探究根腐病的發(fā)生機理，尋找病害發(fā)生的預警生物指示因子，為黃芪土壤微生態(tài)的生物調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及土樣采集

樣品采自山西省大同市渾源縣仿野生黃芪種植基地，地處113.72°E～113.76°E， 39.41°N～39.48°N，海拔1 708.80～1 989.40 m。根據(jù)當?shù)匕l(fā)病情況，定向選擇1～6年生的黃芪健康地塊和發(fā)病地塊進行樣品采集，各地塊管理方法完全一致，且土質(zhì)均為砂質(zhì)土。5點取樣法采集根圍病/健土壤樣本，根據(jù)地塊大小，每個取樣點的間隔距離約為5～8 m。每點采集3～5株黃芪根圍半徑10 cm、深度10 cm之內(nèi)的土壤，去除草根、石礫等雜物后，裝入無菌自封袋作為試驗子樣品。帶回實驗室后取子樣品各100 g混合均勻得最終試驗樣品，一部分保存于4℃冰箱，用于微生物類群分析;另一部分保存于-80℃冰箱，用于分子試驗。采樣的同時調(diào)查該地塊根腐病的發(fā)病率。

1.2 細菌、真菌和放線菌的分離計數(shù)

根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果選取代表性土壤進行計數(shù)分析，包括發(fā)病率較低的1、2年生病/健土和發(fā)病率較高的3、4年生病/健土。參考周永強等[12]的方法

分離各類微生物：取土樣5 g，置于盛有45 mL無菌水（內(nèi)置30粒滅菌玻璃珠）的三角瓶內(nèi)，搖床振蕩（160 r/min，28℃）30 min得土壤懸浮液，梯度稀釋至10-4。每梯度取200 μL涂布平板，每濃度涂布3次。細菌平板32℃恒溫培養(yǎng)，48 h時計數(shù);真菌和放線菌平板28℃恒溫培養(yǎng)，分別在72 h和120 h時計數(shù)。細菌：肉汁胨培養(yǎng)基（BPA）;真菌：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），同時加入適量（0.1 g/L）氯霉素;放線菌：高氏1號培養(yǎng)基（GA）。試驗設3次重復。采用Microsoft Excel 2016處理數(shù)據(jù)，SPSS 16.0進行方差分析。

1.3 細菌DNA的提取及16S rDNA V3區(qū)的PCR擴增

參考徐巖等[13]的方法提取土壤中的細菌DNA，所得DNA溶液保存于-20℃冰箱中。以提取的DNA為模板，338F（GC）： 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGG-AGGCAGCAG-3′和518R： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′為引物[14]進行PCR擴增。50 μL反應體系：DNA模板1 μL;Taq PCR Master Mix 25 μL;引物各1 μL;ddH2O 22 μL。PCR程序：94℃預變性5 min;95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán);最終72℃延伸10 min。

1.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）及條帶的回收

采用Bio-Rad公司DcodeTM基因突變檢測系統(tǒng)（Bio-Rad Lab，LA，USA）電泳分離PCR反應產(chǎn)物。聚丙烯酰胺膠濃度為8%（m/V），變性梯度為35%～60%。電泳運行條件：1×TAE電泳緩沖液，75 V電壓，60℃恒溫、恒壓電泳11.5 h。采用4S Red Plus Nucleic Acid進行染色、成像，并保存DGGE圖譜。圖譜經(jīng)軟件Quantity One 4.6.2分析后，輸出各樣品中每個條帶的豐度值。以豐富度指數(shù)（S）、均勻度指數(shù)（J）和香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）為指標比較各樣品的細菌多樣性。多樣性計算公式[15]如下：

H′=-Σ Piln Pi;

J =H′/Hmax=H′/lnS

式中：Pi=ni/N，ni是第i條條帶的豐度，N為樣品中所有條帶的總豐度;Hmax=lnS，S為樣品中總的條帶數(shù)。

DGGE圖譜中主要的共有及特異性條帶采用SIMCA軟件進行主成分分析（PCA）分析。

1.5 16S rRNA V3區(qū)基因測序及系統(tǒng)進化分析

切取DGGE圖譜中共有及特異性的優(yōu)勢條帶，放入2 mL滅菌離心管中。50 μL無菌水沖洗3次，加入30 μL無菌水，4℃過夜，上清液作為模板用于PCR擴增，反應體系同1.3，引物為338F（無GC夾）和518R。PCR產(chǎn)物由英濰捷（上海）貿(mào)易有限公司完成測序，將有效序列在NCBI上進行比對，同時取同源性高的典型菌株的基因序列作為參比對象，通過MEGA 6.0軟件，鄰接法（neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情調(diào)查

對山西渾源黃芪的根腐病發(fā)病情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1、2年生黃芪發(fā)病率最低，3年時發(fā)病率明顯升高，4、5年時逐漸加重，6年時又開始降低，且此時若不發(fā)病，以后則基本不會發(fā)病。本研究中1～6年生黃芪采樣地塊的發(fā)病率分別為：3.33%、10.00%、26.67%、36.67%、43.33%、33.33%。

2.2 黃芪根圍土壤的微生物區(qū)系分析

1～4年生黃芪根圍土中，病土的微生物總量均顯著高于健土。其中，細菌總量均顯著高于健土且3年生差異最大;真菌總量1、2年生無顯著改變，3、4年生顯著低于健土;放線菌總量均低于健土，且除2年生外都差異顯著。同時，無論病土還是健土中，細菌的數(shù)量和占總量的比例均遠遠高于真菌和放線菌，具體順序為細菌>放線菌>真菌（表1）?？梢?，細菌為黃芪根圍土中的優(yōu)勢菌，是影響病土微生物數(shù)量顯著高于健土的關(guān)鍵因子。

2.3 基于DGGE的黃芪根圍病/健土細菌多樣性比較

試驗提取了黃芪根腐病發(fā)病的代表性階段（1～6年生）根圍病/健土的細菌DNA，其條帶大小為15 kb左右，16S rRNA V3區(qū)擴增的PCR產(chǎn)物為230 bp左右。對該產(chǎn)物進行DGGE分析，發(fā)現(xiàn)各樣品中條帶的數(shù)量和亮度明顯不同，表明不同樣品中細菌的種類和量有所差異（圖1）。

根據(jù)圖譜中每條條帶的信息，綜合分析樣品中細菌的豐富度指數(shù)（S）、均勻度指數(shù)（J）和多樣性指數(shù)（H′）。

物種豐富度指一個群落或生境中物種數(shù)目的多少，物種均勻度指一個群落或生境中全部物種個體數(shù)目分配的均勻程度，而物種多樣性是物種豐富度和物種均勻度的綜合指標。結(jié)果顯示，1～6年生黃芪根圍病土與健土的豐富度指數(shù)無顯著差異;1年生黃芪根圍病土與健土的均勻度指數(shù)和多樣性指數(shù)也均無顯著差異;2～5年生病土中除3年生的均勻度指數(shù)和健土持平外，2、4、5年生均顯著小于健土;此期間香農(nóng)多樣性指數(shù)則全部小于健土，且2年和5年生病健土之間差異顯著;6年生黃芪根圍病土均勻度和多樣性指數(shù)均略有恢復并高于健土，但差異不顯著（表2）。結(jié)合發(fā)病情況分析可知，2～5年生黃芪發(fā)病率逐年上升，病土中的細菌多樣性指數(shù)隨之逐漸降低，而6年時發(fā)病率開始降低，多樣性又有所回升，說明細菌多樣性的降低是根腐病發(fā)生加重的原因之一。此外，病土中細菌的多樣性低于健土，其原因主要在于某些細菌的分配均勻度發(fā)生了改變。

對各樣品的DGGE條帶進行PCA分析發(fā)現(xiàn)，1年生病/健土在PC2水平上呈分離趨勢，2～6年生病/健土則均在PC1水平上明顯分離（圖2），表明從主要的共有和特異性條帶的種類及豐度來看，1年生病/健土間細菌多樣性差異較小，2～6年生病/健土間差異逐漸加大，進一步印證了田間調(diào)查和多樣性分析的結(jié)果。

2.4 黃芪根圍土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

多樣性分析明確了黃芪根圍病土中細菌多樣性的降低因均勻度改變而引起，但無法確定是哪些菌的數(shù)量與分布發(fā)生了變化。因此，需對共有條帶和特異性條帶進行測序和鑒定。本試驗共回收條帶17條，其中優(yōu)勢條帶16條（除1外）（圖1）。所有樣品的共有條帶為6和16，健土中特異性條帶為1和4，病土中無特異性條帶，其他均為部分樣品共有條帶。

將17個條帶的測序結(jié)果進行BLAST比對，與比對菌株同源性大于98%的暫定為相似種，大于90%而小于98%的暫定為潛在新種[10，16]。結(jié)果顯示條帶8、9、10、11、12和13的序列比對同源性大于90%但小于98%，可能為潛在新種。構(gòu)建其他11個條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹，除15號外均屬于變形桿菌門Proteobacteria，且主要分布于γ-變形桿菌綱的假單胞菌屬Pseudomonas、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas和β-變形桿菌綱的無色桿菌屬Achromobacter（圖3）。

在鑒定出的細菌中，7株屬假單胞菌屬Pseudomonas，2株屬無色桿菌屬Achromobacter，1株屬寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas。上述菌株的數(shù)量隨發(fā)病程度變化而不同。其中，6號未培養(yǎng)假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.和16號無色桿菌Achromobacter sp.在各樣品中均有分布。將這二者的豐度與黃芪發(fā)病率進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)6號未培養(yǎng)假單胞菌的豐度與發(fā)病率呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.819（P<0.05）;16號無色桿菌的豐度與發(fā)病率無相關(guān)性，但3年生豐度較1～2年生顯著升高，呈現(xiàn)特異性變化，4～6年時豐度則又顯著下降（表3）。此外，對于健土中的特異條帶，1號經(jīng)鑒定為未培養(yǎng)的假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.，4號為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens。

3 討論

越來越多的證據(jù)顯示：根際土壤微生物的數(shù)量、種類、代謝活性及微生物間的相互作用決定著植物的健康狀況。從土壤微生物區(qū)系、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的角度分析土壤的健康狀態(tài)，探討土傳病害的發(fā)生機理，對病害的生物調(diào)控和防治具有很好的指導意義。

與其他微生物區(qū)系的研究結(jié)果相比，本研究各樣品中黃芪根圍微生物的數(shù)量相對小一些，但與孫窗舒對內(nèi)蒙古黃芪根際土壤微生物[17]的研究結(jié)果相近。有文獻報道，根際微生物數(shù)量往往大于非根際微生物的數(shù)量[18]，且砂質(zhì)土壤的微生物含量也低于壤土[19]，而本研究進行試驗的黃芪種植地區(qū)土壤為砂質(zhì)土，且采集的樣本為根圍土，這也可能是導致試驗中微生物數(shù)量相對較低的原因。

大量文獻報道根際土壤微生物多樣性與植物健康正相關(guān)[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)黃芪根腐病的發(fā)病率與根圍土壤中細菌多樣性的改變密切相關(guān)，多樣性降低發(fā)病加重，反之發(fā)病減輕或植株保持健康，這與Wang等[7]及Yang 等[20]對煙草青枯病的研究結(jié)果一致。然而，也有結(jié)論與此相反，如陳波等[21]發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病發(fā)病土壤的細菌多樣性比健康土壤更豐富，這一現(xiàn)象可能與作物、土壤種類以及生長環(huán)境的差異有關(guān)。

群落結(jié)構(gòu)分析表明，假單胞菌屬是黃芪根圍土壤中的優(yōu)勢種群。作為根際土壤細菌群落的主要成員之一，該屬細菌的許多種具有抑制植物病原菌、促進植物生長的作用[22]。本研究中6號未培養(yǎng)假單胞菌的豐度與根腐病發(fā)病率呈顯著負相關(guān)，推測其可能為某種有益拮抗菌，其數(shù)量降低導致病原菌侵染加重，發(fā)病率上升，故可作為土壤健康和黃芪根腐病發(fā)生的潛在指示因子，但其分類歸屬、在土壤中的作用和動態(tài)變化等還有待進一步研究。此外，健康土壤中的4號特異性條帶被鑒定為熒光假單胞菌，該菌具有優(yōu)良的抗病能力[23]，是近幾十年來研究報道最多、最具應用價值的一類生防菌，其在健康土壤中的特異性存在，也表明其是一種土壤健康的指示因子。另外，16號無色桿菌的豐度在根腐病發(fā)病率明顯升高的第3年顯著升高，但在4～6年時又急劇降低，盡管二者不具有相關(guān)性，但文獻報道一些無色桿菌屬細菌可通過誘導或增強SOD和POD活性、合成ACC脫氨酶、降低葉片中MDA含量來減輕番茄在鹽脅迫下的損傷[24]或調(diào)節(jié)乙烯對根系生長的抑制作用，促進接種植物根系的延伸[25]。據(jù)此我們推測，16號無色桿菌也可能作為一種有益菌，在土壤健康狀態(tài)的保持或黃芪的抗病性中起一定作用，但其與根腐病發(fā)生的相關(guān)性還需加以確定。

調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)：黃芪連續(xù)種植6年后，根腐病發(fā)病率不升反降。有文獻報道，連續(xù)種植小麥全蝕病感病品種可以誘導土壤中產(chǎn)抗生素2，4-DAPG的熒光假單胞菌類群大量增加[26]。連續(xù)單一種植草莓15年的土壤再種植草莓，枯萎病的發(fā)病率很低，土壤具備了抑制性，且與種植草莓3年的土壤相比，放線菌門Actinobacteria、變形桿菌門Proteobacteria和酸桿菌門Acidobacteria細菌在15年的土壤中更為豐富[27]。由此推測，6年生黃芪發(fā)病率的降低也可能預示著連續(xù)種植誘導出了土壤的抑病特性，特別是有益拮抗菌的增加，抑制或抵抗了黃芪根腐病菌的侵染。

上述研究初步明確了黃芪根腐病病/健株根圍土壤微生物菌群的變化，但通過16S rDNA V3區(qū)的PCR擴增鑒定回收條帶的分類地位，大部分菌株僅僅鑒定到了屬，還有6個菌株由于比對相似性低而難以確定歸屬，而且所鑒定的條帶中，僅有2條屬于所有樣品的共有條帶。這些因素都可能降低尋找土壤健康指示因子的覆蓋面和準確度。同時，每個DGGE條帶代表的不只是一種細菌，僅憑該技術(shù)進行微生物群落結(jié)構(gòu)的研究也有一定的缺陷。因此，目前尋找到的指示菌是否能夠真正用于指導病害發(fā)生檢測和生防調(diào)控，還必須深入、全面地研究和驗證。

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（責任編輯：田 喆）