張巧利，劉英，賈嬋維，劉艷君，卜曉萌，王樹玉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，北京 100026)

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，截止2014年，全球有超過6億成年人肥胖，其中女性占15%，是1980年數(shù)據(jù)的2倍多[1]。英國政府數(shù)據(jù)顯示，1993至2012年女性重度肥胖的發(fā)病率由15%升至25%[2]；一項世界性調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國女性肥胖的發(fā)病率為10%[3]，肥胖在育齡女性中越來越普遍。眾所周知，肥胖會影響女性的月經(jīng)和排卵[4]，可引起胰島素抵抗，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[5]，因此肥胖對女性生殖健康的影響是目前研究的熱點。

肥胖和各種不健康的生活方式有直接關(guān)系，研究表明肥胖也可以多基因遺傳，內(nèi)生的DNA變異使得一些人群易感肥胖[6]。肥胖自發(fā)突變的純合子小鼠(Lepob，通常為ob/ob)為自發(fā)性肥胖，背景為C57BL/6J，因瘦素(leptin)基因點突變導(dǎo)致leptin信號通路發(fā)生障礙，是自發(fā)性肥胖癥動物模型。ob/ob小鼠出生大約4周時可看到表型，純合子突變小鼠表現(xiàn)為體重迅速增加，可達野生型對照鼠正常體重的3倍。突變鼠除了肥胖以外還表現(xiàn)出攝食過量、糖尿病樣高血糖綜合征、生殖力降低，以及垂體和腎上腺激素水平升高。本文以ob/ob小鼠為研究對象，觀察其糖和脂代謝，探索卵泡超微結(jié)構(gòu)變化，以揭示人群中具有同樣基因異常問題的自發(fā)性肥胖癥女性的卵泡發(fā)育狀況，為這類人群的生殖健康研究提供實驗室依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物與試劑

1.實驗動物：15只4周齡雌性C57BL/6J小鼠(批號：XAJT2013-035)由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，體重9.6～17.0 g；15只4周齡雌性ob/ob小鼠(批號：BCM059F2013-052)購自北京百奧賽圖公司，體重20.5～30.5 g。小鼠飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。所有小鼠于SPF清潔級環(huán)境普通飼料飼養(yǎng)120 d，5只/籠，飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫20～25℃，相對濕度60%，12 h明暗周期，所有小鼠均自由進食和飲水，定期更換墊料，每隔2周用電子秤清晨9時測小鼠體重。動物實驗獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準。

2.試劑與儀器：小鼠血清胰島素(Insulin，INS)、雌二醇(E2)和睪酮(T)ELISA檢測試劑盒購自美國ALPCO公司；四氧化鋨購自英國Johnson Matthey Chemicals公司；環(huán)氧樹脂購自美國SPI Supplies Division of Structure Probe公司；醋酸雙氧鈾購自加拿大Ted Pella公司；血脂檢測試劑盒(甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇)購自上海盈公生物技術(shù)有限公司；血糖試紙購自上海強生制藥有限公司；毛細玻璃管購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LKB-Ⅴ型超薄切片機購自瑞典LKB公司；JEM-100SX透射式電子顯微鏡購自日本電子公司；IX70倒置顯微鏡和SZX9解剖鏡購自日本Olympus公司；自動染色機、樣品處理機購自德國Leica公司；多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司；臺式低溫高速離心機購自美國Thermo公司；MDF-382E超低溫冰箱購自日本SANYO公司；強生血糖測試儀購自上海強生制藥有限公司。

二、小鼠標本的獲取

兩組小鼠喂食100 d時進行葡萄糖耐受試驗(GTT)，5 d后進行胰島素釋放試驗(ITT)。兩組小鼠喂食120 d時，禁食12 h，早晨先用血糖測試儀測空腹血糖(FBG)，之后采用苯巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血獲得血樣，室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80℃冰箱凍存，后期進行INS、血脂和性激素(E2和T)檢測。

小鼠摘眼球取血完畢，打開腹腔摘取雙側(cè)卵巢，剝離卵巢周圍的脂肪組織，稱量并記錄。

三、小鼠糖代謝指標檢測

1.葡萄糖耐受試驗：對C57BL/6J小鼠和ob/ob小鼠進行GTT，小鼠禁食過夜(16 h)，按照2 g/kg體重的量腹腔注射葡萄糖，測0、30、60、90、120 min時的血糖。

2.胰島素耐受試驗：GTT試驗5 d之后進行ITT，小鼠禁食4 h，按照0.75 U/kg體重的量腹腔注射胰島素，測0、30、60、90、120 min時的血糖。

3.小鼠空腹血糖檢測：兩組小鼠喂食120 d于處死當天，禁食12 h，清晨使用血糖試紙收集小鼠剪尾后的血液進行FBG檢測，在血糖測試儀上讀數(shù)并記錄。

4.小鼠胰島素水平檢測：按照小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒說明書測定各組小鼠血清INS水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

四、小鼠血脂水平檢測

采用酶法進行總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)測定，采用磷鎢酸-鎂沉淀法進行高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測，采用聚乙烯硫酸沉淀法檢測低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，以上指標檢測的操作步驟均按試劑盒說明書進行。

五、性激素水平檢測

運用ELISA法檢測兩組小鼠血清標本E2和T水平。

六、小鼠卵巢組織透射電鏡觀察

將小鼠卵巢組織切成1 mm3的小塊，置于2.5%的戊二醛固定液中4℃固定2 h以上(固定液內(nèi)含有0.1 mol/L磷酸緩沖液、4%多聚甲醛)；0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗30 min，1%四氧化鋨固定液4℃后固定2 h(固定液內(nèi)含有0.1 mol/L磷酸緩沖液)，0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗10 min，乙醇梯度脫水(30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min)，70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染2 h或過夜；90%乙醇10 min×2次，100%乙醇10 min×3次，還氧丙烷置換10 min；環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2 μm，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位；超薄切片機進行超薄切片50～70 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色；透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、體重曲線變化

兩組小鼠正常喂食120 d，體重曲線變化見圖1。ob/ob組小鼠出生4周時體重顯著高于對照組C57BL/6J小鼠(P<0.01)。此后直至喂食結(jié)束，ob/ob組小鼠體重每次測量均較對照組小鼠重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

與對照組比較，*P<0.01，#P<0.001圖1 兩組小鼠體重曲線變化

二、糖代謝指標比較

喂食120 d后，ob/ob小鼠的FBG、INS以及HOMA-IR均較對照組小鼠顯著升高(P<0.05)(表1)。GTT和ITT試驗顯示，ob/ob小鼠血糖濃度分別在檢測時間點0、30、60、90和120 min時均較對照組C57BL/6J小鼠顯著升高(P<0.01)，而且GTT和ITT的AUC也均較對照組小鼠顯著升高(P<0.001)(圖2～5)。

表1 兩組小鼠糖代謝指標的比較(-±s)

三、血脂水平比較

喂食結(jié)束后，ob/ob小鼠的血脂水平(TG、TC、HDL-C和LDL-C)均較正常對照組小鼠顯著升高(P<0.05)(表2)。

與對照組比較，*P<0.01，#P<0.001圖2 兩組小鼠GTT曲線圖

與對照組比較，*P<0.01，#P<0.001圖3 兩組小鼠ITT曲線圖

與對照組比較，*P<0.001圖4 兩組小鼠葡萄糖耐受試驗AUC

與對照組比較，*P<0.001圖5 兩組小鼠胰島素釋放試驗AUC

表2 兩組小鼠血脂水平的比較(-±s)

四、性激素和性腺脂肪的變化

與對照組C57BL/6J小鼠相比，ob/ob組小鼠血清T水平下降(P<0.05)，但E2水平無顯著變化(表3)；ob/ob組小鼠卵巢周圍脂肪組織(性腺脂肪)重量及其占體重的比列顯著高于對照組(P<0.001)(圖6、7)。

表3 兩組小鼠性激素水平的比較(-±s)

與對照組比較，*P<0.001圖6 兩組小鼠性腺脂肪重量的比較

與對照組比較，*P<0.001圖7 兩組小鼠性腺脂肪重量/體重的比較

五、小鼠卵泡超微結(jié)構(gòu)改變

對照組C57BL/6J小鼠卵泡超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)：電鏡下見到原始卵泡的卵母細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁可見，其周圍可見單層扁平的卵泡細胞。初級卵泡及次級卵泡中的卵母細胞體積較大，細胞核較小，形狀不規(guī)則(圖A，10 000×)，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，核膜上的核孔清晰可見(圖B，30 000×)。卵母細胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富(圖C，30 000×)，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈板層或環(huán)形排列，線粒體呈圓形，細胞質(zhì)內(nèi)還可見到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體(圖D，30 000×)及皮質(zhì)顆粒；卵母細胞周圍的顆粒細胞由單層變?yōu)槎鄬?，其間可見卵母細胞的微絨毛及顆粒細胞的突起(圖E，30 000×)。卵母細胞和顆粒細胞，結(jié)構(gòu)完整，透明帶電子密度均勻(圖F，3 000×)。

相較于對照組C57BL/6J小鼠，ob/ob小鼠原始卵泡中卵母細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹(圖G，30 000×)；初級卵泡及次級卵泡中的卵母細胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)疏松，核仁可見(圖H，3 000×)；細胞質(zhì)內(nèi)細胞器不多，線粒體內(nèi)灶狀溶解且多呈高電子密度(圖I，4 000×)。透明帶電子密度和厚度不均勻，部分透明帶溶解缺失，連續(xù)性中斷(圖J，10 000×)；卵母細胞周圍的顆粒細胞排列紊亂，細胞多呈凋亡樣改變(圖K，4 000×)；顆粒細胞穿過透明帶與卵母細胞靠近接觸，透明帶內(nèi)顆粒細胞的突起消失(圖L，4 000×)。

A～F為對照組小鼠；G～L為ob/ob小鼠。A：初級卵泡的卵母細胞核(箭頭所示)可呈不規(guī)則形；B：卵母細胞的核膜可見清晰的核孔(箭頭所示)；C：卵母細胞核糖體發(fā)達(箭頭所示)，形態(tài)和數(shù)目正常；D：卵母細胞質(zhì)內(nèi)的高爾基體(紅色箭頭所示)形態(tài)規(guī)整，可見囊泡(白色箭頭所示)；E：卵母細胞外圍有豐富的微絨毛(箭頭所示)伸入至透明帶；F：顆粒細胞(箭頭所示)形態(tài)規(guī)整，透明帶厚度和電子密度均勻；G：原始卵泡中卵母細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹(箭頭所示)；H：卵母細胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)疏松(箭頭所示)；I：線粒體內(nèi)灶狀溶解且多呈高電子密度(箭頭所示)；J：部分透明帶溶解缺失，連續(xù)性中斷(箭頭所示)；K：顆粒細胞排列紊亂，細胞多呈凋亡樣改變(箭頭所示)；L：透明帶厚度不均勻，顆粒細胞穿過透明帶與卵母細胞靠近接觸(紅色箭頭所示)，透明帶內(nèi)顆粒細胞突起消失(白色箭頭所示)圖8 兩組小鼠卵泡超微結(jié)構(gòu)圖像

討 論

近20年來，我國超重或肥胖的人群患病率逐年增多，呈流行態(tài)勢。中國健康營養(yǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[7]，從1993年到2009年的17年間，成人超重/肥胖的患病率從13.4% 增長至 26.4%，總體呈線性增長，自發(fā)性肥胖癥的群體也越來越被關(guān)注。近30年來育齡女性超重和肥胖的患病率也呈顯著上升趨勢，肥胖除了影響女性月經(jīng)外，還影響排卵、卵母細胞質(zhì)量，胚胎發(fā)育以及子宮內(nèi)膜容受性[8]?，F(xiàn)有證據(jù)表明肥胖對下丘腦-垂體-卵巢軸和卵泡發(fā)育的影響程度與體重正相關(guān)[9]。研究認為胰島素抵抗和氧化應(yīng)激炎癥是常見的影響介質(zhì)[10]。

本研究顯示自發(fā)性肥胖癥ob/ob小鼠4周時體重便較對照組小鼠明顯重，而且隨著喂養(yǎng)時間延長，體重超重程度更為顯著。盡管喂食正常飼料，喂食120 d時ob/ob小鼠糖代謝主要指標顯著異常，出現(xiàn)空腹血糖升高、胰島素抵抗，甚至發(fā)生糖尿??；同時主要血脂代謝指標也發(fā)生顯著異常，ob/ob小鼠表現(xiàn)為代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)[11]。

理論上肥胖女性的高胰島素血癥和胰島素抵抗會降低肝臟產(chǎn)生性激素結(jié)合球蛋白，導(dǎo)致循環(huán)中游離雄激素水平升高，阻礙卵泡的募集和排卵[12]。由于ob/ob小鼠糖脂代謝嚴重紊亂；卵巢超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著異常改變；ob/ob小鼠卵巢周圍的脂肪組織顯著超標，脂肪組織可以分泌多種炎癥因子[13]，以上因素嚴重損害了ob/ob小鼠卵巢功能，可能阻礙了卵巢T的合成。

卵泡的生長與成熟是通過FSH和 LH作用于顆粒細胞和卵泡膜間質(zhì)細胞，并通過自分泌、旁分泌和胞內(nèi)分泌及一系列信息傳遞和調(diào)節(jié)機制完成[14]。顆粒細胞與卵母細胞之間或顆粒細胞之間有許多縫隙連接，形成完整的功能聯(lián)合體，顆粒細胞的突起和卵母細胞的微絨毛可深入透明帶發(fā)生接觸，有利于顆粒細胞將營養(yǎng)物質(zhì)輸送給卵母細胞以及細胞間離子、激素和小分子物質(zhì)的交換，溝通信息，協(xié)調(diào)功能，從而調(diào)節(jié)卵母細胞的生長和發(fā)育。當受不良環(huán)境影響或相關(guān)基因發(fā)生異常時，卵母細胞及顆粒細胞的細胞器、數(shù)量、分布、結(jié)構(gòu)、功能等均將發(fā)生相應(yīng)改變。早些年學(xué)者已證實卵泡閉鎖與顆粒細胞凋亡過度密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果提示，ob/ob小鼠卵母細胞形態(tài)欠規(guī)則，細胞器出現(xiàn)損傷(線粒體為主)，顆粒細胞出現(xiàn)凋亡，部分卵母細胞核染色質(zhì)排列紊亂；透明帶形態(tài)或厚度異常；卵母細胞微絨毛明顯減少。這些超微結(jié)構(gòu)的改變使卵泡不能維持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，最終影響機體的生殖健康。加之ob/ob小鼠存在嚴重的糖和脂代謝障礙，更加重了對生殖健康的負性影響。

自發(fā)性肥胖癥ob/ob小鼠自幼體重超重，隨著繼續(xù)生長出現(xiàn)糖和脂代謝嚴重紊亂，出現(xiàn)代謝綜合征，電子顯微鏡下觀察到卵泡超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的病理損傷性改變，提示自發(fā)性肥胖癥雌性個體存在嚴重的生殖健康問題。目前隨著人類疾病譜的復(fù)雜化和生存環(huán)境的惡化，人群中這種由于基因缺失或突變的自發(fā)性肥胖癥女性將會逐漸增多。本研究以小鼠模型為代表，對其代謝特征和卵泡超微結(jié)果進行初探，欲揭示這種基因異常對生殖健康的影響機制，期望伴隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，能夠開發(fā)出有效的干預(yù)方法，改善這個群體的生殖健康。