李圓圓 郝寶珍 孟云芳

1山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院皮膚科，山東濟(jì)南，250021；2山東省婦幼保健院，山東濟(jì)南，250014

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種反復(fù)發(fā)作并伴有劇烈瘙癢的慢性炎癥性皮膚疾病。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，T細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)對(duì)AD的發(fā)生發(fā)展可能起主要作用[1，2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylaspirate-specific proteinases, caspases)是細(xì)胞凋亡過程中的重要因子，近年發(fā)現(xiàn)，該家族部分成員(尤其是caspase-3及caspase-8)在T細(xì)胞活化與增殖中亦發(fā)揮重要作用[3,4]，有可能成為免疫性及炎癥性疾病新的治療方向。目前對(duì)caspase在炎癥性皮膚病中的研究較少。我們既往的研究表明，廣譜caspase抑制劑芐氧羧基-纈氨酰-丙氨酰-門冬氨酰氟甲基酮(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone, Z-VAD-FMK)可以抑制小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎[5,6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[7]，AD患者急性期皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中caspase-3表達(dá)增加，但他們的研究結(jié)果局限在表皮內(nèi)，沒有觀察真皮及血液內(nèi)的淋巴細(xì)胞中caspases表達(dá)的情況，亦沒有用caspase抑制劑進(jìn)行干預(yù)并觀察干預(yù)后的變化。本實(shí)驗(yàn)以AD患者為對(duì)象，將廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK與患者外周血單一核細(xì)胞(blood mononuclear cells, PBMCs)體外共培養(yǎng)，研究caspase抑制劑在體外對(duì)AD患者T細(xì)胞免疫異常的影響。該研究將為從阻斷caspase方面來治療包括AD在內(nèi)的免疫性及炎癥性皮膚病提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研制新型抗免疫及抗炎癥藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 AD患者30例，其中男17例，女13例，年齡18～65歲，平均40.6歲，所有患者均符合Williams標(biāo)準(zhǔn)。在2周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素類藥物及口服抗組胺藥物，4周內(nèi)未系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。對(duì)照組30例均為本院體檢的健康成人，其中男18例，女12例，年齡22～60歲，平均38.5歲，無特應(yīng)性疾病病史。兩組性別與年齡比較，其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 Z-VAD-FMK購自美國(guó)Promega公司，使用時(shí)用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)稀釋。地塞米松購自美國(guó)Sigma公司，使用時(shí)用PBS稀釋。佛波酯和離子霉素購自美國(guó)Alexis公司，莫能霉素購自美國(guó)Sigma公司。PE-Cy5標(biāo)記的抗人CD3單抗、FITC標(biāo)記的抗人CD8單抗、PE標(biāo)記的同型對(duì)照IgG1單抗購自美國(guó)BD公司。PE標(biāo)記的抗人γ干擾素(IFN-γ)、人白細(xì)胞介素4(IL-4)、人白細(xì)胞介素17(IL-17)單抗購自美國(guó)eBioscience公司。人IFN-γ、IL-4、IL-17 ELISA試劑盒購自美國(guó)eBioscience公司。

1.2.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀型號(hào)為FACSCalibur，系美國(guó)BD公司產(chǎn)品，ELISA檢測(cè)儀為美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 單一核細(xì)胞分離 取30例AD患者及30例健康對(duì)照肝素抗凝血5 mL，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMCs，重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞亞群 取上述PBMC懸液1 mL，接種于24孔板，加入佛波酯(終濃度50 μg/L)+離子霉素(終濃度1 mg/L)及莫能霉素(終濃度1 μmol/L)，37℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。然后把細(xì)胞懸液移至1.5 mL離心管，1500 r/min離心5 min，棄上清，PBS溶液洗2次后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。由于佛波酯可以減弱CD4的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)未采用熒光素標(biāo)記的CD4抗體，而用CD3+CD8-細(xì)胞群代替CD4+細(xì)胞群。

1.3.3 ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子 取上述PBMC懸液1 mL，接種于24孔板，將30例AD患者的PBMC均分3孔，每孔均加入佛波酯(終濃度50 μg/L)+離子霉素(終濃度1 mg/L)，然后再分別加入等量的Z-VAD-FMK溶液、地塞米松溶液及PBS溶液，使Z-VAD-FMK終濃度為100 μmol/L，地塞米松終濃度為250 nmol/L。置于37℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后把細(xì)胞懸液移至1.5 mL離心管，1500 r/min離心5 min，收集上清液。ELISA方法檢測(cè)上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的濃度。

2 結(jié)果

2.1 AD患者外周血單一核細(xì)胞中Th1、Th2、Th17細(xì)胞比例 佛波酯+離子霉素刺激培養(yǎng)AD患者及健康對(duì)照PBMC 4 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，AD患者組CD3+CD8-IFN-γ+(Th1)細(xì)胞比例低于健康對(duì)照組(P<0.01)，CD3+CD8-IL-4+(Th2)細(xì)胞比例明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，CD3+CD8-IL-17+(Th17)細(xì)胞比例明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)。見表1、圖1。

1a、1c、1e:AD患者；1b、1d、1f:健康對(duì)照

表1 AD患者及健康對(duì)照組外周血表達(dá)不同細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞亞群水平

2.2 Z-VAD-FMK對(duì)AD患者外周血單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-4、IL-17的影響 AD患者PBMCs中加入佛波酯+離子霉素刺激培養(yǎng)，然后再分別加入等量的Z-VAD-FMK溶液(終濃度100 μmol/L)、地塞米松溶液(終濃度250 nmol/L)及PBS溶液，培養(yǎng)24 h，ELISA方法檢測(cè)上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的濃度。結(jié)果顯示，與PBS處理組這一陰性對(duì)照相比，Z-VAD-FMK處理組與地塞米松處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與地塞米松處理組這一陽性對(duì)照相比，Z-VAD-FMK處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2、圖2。

表2 廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)特應(yīng)性皮炎患者外周血單一核細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17的影響

圖2 Z-VAD-FMK對(duì)特應(yīng)性皮炎患者外周血單一核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

3 討論

特應(yīng)性皮炎是一種慢性、反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚病，主要癥狀有劇烈的瘙癢、廣泛的紅斑脫屑等濕疹樣皮損以及干皮癥等，嚴(yán)重影響患者及其家人的生活。在過去30年中，許多國(guó)家特應(yīng)性皮炎的患病率大幅度增加。特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為AD是遺傳、環(huán)境、皮膚屏障功能缺陷和免疫異常共同作用的多基因復(fù)雜疾病，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)一直是AD發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。以往多項(xiàng)研究表明，Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2平衡失調(diào)是免疫介導(dǎo)的AD發(fā)生環(huán)節(jié)之一。Th17是新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，有研究顯示，AD患者外周血和皮損中Th17細(xì)胞數(shù)量均增多，其百分比與疾病本身的嚴(yán)重程度相關(guān)[8,9]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了AD患者外周血單一核細(xì)胞中Th1、Th2、Th17細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，Th1細(xì)胞明顯下降，Th2與Th17細(xì)胞明顯升高，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[2,9]。

近年來的研究表明，caspases不僅參與細(xì)胞凋亡，其在T細(xì)胞增殖與活化中亦發(fā)揮著重要作用。主要體現(xiàn)在以下方面：T細(xì)胞體外活化過程中檢測(cè)到多種caspases的活性；caspase-8失活后導(dǎo)致了人與鼠T細(xì)胞免疫缺陷；體外實(shí)驗(yàn)中，caspase抑制劑能阻斷抗CD3單抗、有絲分裂原及超抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖與活化。目前，關(guān)于在體內(nèi)研究caspases在T細(xì)胞活化中的作用以及caspase抑制劑抗免疫反應(yīng)的報(bào)道較少。Iwata等[10]將廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK應(yīng)用于小鼠哮喘模型，他們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈注射Z-VAD-FMK進(jìn)行干預(yù)后，小鼠氣道及肺血管中炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，黏液分泌及Th2細(xì)胞因子分泌也減少，T細(xì)胞在體外受到刺激后產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子的能力也明顯下降。我們既往研究亦表明，外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK治療小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)有一定的療效[5]，且可以抑制小鼠ACD的激發(fā)[6]。國(guó)內(nèi)外尚未見到將其用于特應(yīng)性皮炎的研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以特應(yīng)性皮炎患者為研究對(duì)象，進(jìn)一步觀察了廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)AD患者PBMCs培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的影響。參照既往文獻(xiàn)報(bào)道[11]，Z-VAD-FMK的終濃度設(shè)為100 μmol/L，以PBS溶液為陰性對(duì)照，以250 nmol/L地塞米松溶液為陽性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照相比，Z-VAD-FMK處理組與地塞米松處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平均顯著降低。這提示，廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)AD患者外周血Th1、Th2、Th17等CD4+T細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的能力均有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與地塞米松處理組這一陽性對(duì)照相比，Z-VAD-FMK處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示，廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)AD患者外周血CD4+T細(xì)胞的抑制作用與250 nmol/L地塞米松相似。

有研究發(fā)現(xiàn)[7]，AD患者急性期皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中caspase-3表達(dá)增加，但他們的研究結(jié)果局限在表皮內(nèi)，沒有觀察真皮內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中caspases表達(dá)的情況，亦沒有用caspase抑制劑進(jìn)行干預(yù)并觀察干預(yù)后的變化。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了caspase抑制后對(duì)AD患者外周血CD4+T細(xì)胞的影響，今后可以對(duì)AD皮損中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究，并進(jìn)一步應(yīng)用至動(dòng)物模型中。

雖然已在部分炎癥性疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到caspase抑制劑抗免疫、抗炎癥的作用，但尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)，考慮可能與相關(guān)研究仍較少有關(guān)。今后需要進(jìn)行更多的研究進(jìn)一步加以驗(yàn)證，為研制新型抗免疫及抗炎癥藥物提供依據(jù)。