邱凱華，李曉駒，方淑梅，梁喜龍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江 大慶 163319）

由于真核生物的結(jié)構(gòu)基因是外顯子與內(nèi)含子相互間隔但又連續(xù)鑲嵌排列而成的斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA 前體（pre-mRNA）并不能作為轉(zhuǎn)錄的模板，必須經(jīng)過剪接加工，去除內(nèi)含子，同時將外顯子連接起來形成成熟的mRNA 才能發(fā)揮作用[1]。pre-mRNA 剪接是剪接體在組裝過程中通過發(fā)動兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)催化完成的。剪接體是由5種核小RNA（U1snRNA、U2snRNA、U4snRNA、U5snRNA、U6snRNA）和多種蛋白質(zhì)形成的5種核小核糖核蛋白（U1snRNP、U2snRNP、U4snRNP、U5snRNP、U6snRNP）及其他輔助蛋白質(zhì)形成的超大分子復合體[2]，其組裝過程主要經(jīng)歷以下幾個階段：（1）U1snRNP 識別內(nèi)含子的5′剪接位點，U2AF（U2snRNP auxiliary factor）與3′端的多聚嘧啶區(qū)（polypyrimidine tract，Py tract）結(jié)合，形成復合體E；（2）U2snRNP 與分支點序列（branchpoint sequence，BPS）結(jié)合，形成復合體A；（3）U4/U6snRNP 與U5snRNP 以復合物形式與復合體A 相互作用，生成復合體B1；（4）U1snRNP 離開剪接體，U6snRNP 識別5′剪接位點，U5snRNP 松散結(jié)合到內(nèi)含子上，形成復合體B2；（5）復合體構(gòu)象重排變成具有催化活性的復合體C。轉(zhuǎn)酯反應(yīng)起始于分支點的2′-OH 攻擊內(nèi)含子5′端的磷酸二酯鍵，上游外顯子產(chǎn)生游離的3′-OH，其攻擊內(nèi)含子3′端的磷酸二酯鍵，與下游外顯子連接起來，同時內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)釋放[2-3]。剪接又可分為組成性剪接與選擇性剪接（也稱可變剪接）。選擇性剪接在高等真核生物中普遍存在，通過從一個基因中以不同方式去除內(nèi)含子而產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄子，可進一步表達為不同生理功能的蛋白質(zhì)，從而增加蛋白質(zhì)的復雜性和多樣性[4-5]，也可能通過無義介導mRNA 降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）機制被降解，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄子的水平[6-8]。剪接與無義介導都在基因表達調(diào)控中起著十分重要的作用。

剪接體的形成始于內(nèi)含子識別，該過程僅需U1snRNP 和少量輔助蛋白質(zhì)即可完成，分支點結(jié)合蛋白（branchpoint-bridging protein，BBP）就是其中重要的分子，在U2AF 大亞基的輔助下正確識別結(jié)合于BPS 上，在幫助拉近5′剪接位點與3′剪接位點的空間距離上起到橋梁作用，是剪接體組裝之初必不可少的核心成員之一[9-12]。研究顯示，BBP 及其同源蛋白在動物、植物、真菌中高度保守，推測其在所有形成剪接體的真核生物中存在[13]。

真菌活動與人類生活密切相關(guān)。真菌不僅參與工業(yè)發(fā)酵、食品添加劑和飼料添加劑生產(chǎn)、異生物質(zhì)降解、纖維素向生物燃料轉(zhuǎn)化等重要過程，有些真菌還會引起人類或動植物的疾病，為此對真菌的研究一直是生命科學領(lǐng)域的重要內(nèi)容[14]。同時，真菌的基因組相對于其他高等真核生物更小、結(jié)構(gòu)更加簡化，并且部分真菌已經(jīng)作為模式生物成為人類探索生命科學奧秘的重要工具[13]。因此，選擇低復雜度的真菌為研究對象對于探究選擇性剪接機理具有重要意義。

本研究對9種常見真菌——稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces tritici）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、白僵菌（Beauveria bassiana）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的BBP進行了生物信息學分析，旨在了解BBP 在這9種真菌中的基本特性及可能的生物學功能，以期為進一步研究BBP 在pre-mRNA 剪接中的作用及其他的生物學功能提供依據(jù)。

1 研究對象及分析方法

1.1 BBP 的基本信息獲取

利用真菌在線網(wǎng)站（http：//fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index），輸入“branchpointbridging protein”檢索獲取稻瘟病菌中BBP 的氨基酸序列，然后通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用同源比對獲取釀酒酵母、小麥全蝕病菌、粗糙脈孢菌、西瓜炭疽病菌、白僵菌、尖孢鐮刀菌、水稻惡苗病菌、立枯絲核菌的BBP 氨基酸序列，同源比對參數(shù)默認。

1.2 BBP 的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析蛋白質(zhì)分子量、等電點、親水性和穩(wěn)定性。

1.3 BBP 的亞細胞定位、信號肽與跨膜螺旋預測

利用DeepLoc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）在線軟件對BBP 進行亞細胞定位；利用SignalIP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件進行信號肽預測；利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和TMpred Server （https：//embnet.vital -it.ch/software/TMPRED_form.html）在線軟件進行跨膜螺旋預測。

1.4 BBP 的二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域分析

利用NPS@（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線軟件預測BBP 二級結(jié)構(gòu)，參數(shù)默認；利用InterPro Scan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequencesearch）在線軟件預測BBP 結(jié)構(gòu)域，利用Dog 2.0 軟件進行結(jié)構(gòu)域繪圖。

1.5 BBP 的系統(tǒng)進化分析

多序列比對后，利用MEGA 7.0.26 軟件中的Neighbor-Joining 法繪制系統(tǒng)進化樹，參數(shù)默認，生成系統(tǒng)進化樹。

1.6 BBP 的三級結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASy 中的Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測并獲取信息。

1.7 BBP 的磷酸化與SUMO 化位點預測

利用DISPHOS 1.3（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）在線軟件預測BBP 的磷酸化位點；利用GPS-SUMO 1.0 軟件預測BBP 的SUMO 化位點，各參數(shù)均設(shè)置為默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BBP 的基本信息獲取

首先通過真菌數(shù)據(jù)庫獲取稻瘟病菌BBP 的蛋白ID 及氨基酸序列，然后通過NCBI 進行同源比對，獲取釀酒酵母、小麥全蝕病菌、粗糙脈孢菌、西瓜炭疽病菌、白僵菌、尖孢鐮刀菌、水稻惡苗病菌、立枯絲核菌中BBP 的蛋白ID、蛋白長度、基因座位、覆蓋度及E值（表1）。其中，稻瘟病菌BBP 的蛋白長度最大，氨基酸數(shù)目為638；釀酒酵母BBP 的蛋白長度最小，氨基酸數(shù)目為458。除稻瘟病菌外，白僵菌BBP 的覆蓋度最高，為96%，E值為0；釀酒酵母BBP的覆蓋度最低，立枯絲核菌次之，分別占比41%和67%，E值分別為1.00E-96 和4.00E-135。

表1 9種真菌中BBP 的信息

2.2 BBP 的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 在線軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。由表2 可知，XP_003709462.1 分子量最大，XP_009226994.1 次之，ONH80283.1 分子量最??；所有蛋白呈堿性；ONH80283.1 等電點最高，為9.56；所有蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。

2.3 BBP 的亞細胞定位、信號肽與跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預測

利用DeepLoc-1.0 在線軟件進行亞細胞定位，結(jié)果顯示，9種真菌的BBP 皆存在于細胞核中；利用SignalIP 4.1 在線軟件進行信號肽預測，結(jié)果顯示，9種真菌的BBP 均不存在信號肽；利用TMHMM Server v.2.0 和TMpred Server 兩個在線軟件對蛋白跨膜螺旋進行預測及分析，結(jié)果顯示，9種真菌的BBP 跨膜區(qū)域為零，無跨膜蛋白，即所研究蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

表2 9種真菌中BBP 的理化性質(zhì)

2.4 BBP 的二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域分析

利用NPS@ 在線軟件預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表3。由表3 可知，無規(guī)則卷曲占比最大，α 螺旋次之，β 折疊和β 轉(zhuǎn)角占比較小。α 螺旋和β 折疊為蛋白質(zhì)最主要的二級結(jié)構(gòu)形式，其中，立枯絲核菌CCO28600.1 的α 螺旋占比最大，為23.41%；釀酒酵母ONH80283.1 占比最小，為15.33%，但是ONH80283.1 的β 折疊占比最高達9.05%，比β 折疊占比最小的小麥全蝕病菌XP_009226994.1 高5.08%。

表3 9種真菌中BBP 的二級結(jié)構(gòu)預測 單位：%

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)的基本單元，具有一定的生物學功能。為了進一步明確BBP 的結(jié)構(gòu)及功能，利用InterPro Scan 在線軟件預測9種真菌中BBP 的結(jié)構(gòu)域，然后利用Dog 2.0 軟件進行結(jié)構(gòu)域繪圖。由圖1 可知，本研究中的蛋白質(zhì)均具有3 個相同的結(jié)構(gòu)域（SF1-HH、KH_dom、Znf_CCHC），除釀酒酵母ONH80283.1 各結(jié)構(gòu)域在肽鏈中的位置與其他蛋白差異較大外，其他各蛋白結(jié)構(gòu)域分布相似。由此推測，ONH80283.1 在高級結(jié)構(gòu)和生物學功能上可能會與其他8種真菌中的BBP 有所差異。

2.5 BBP 的系統(tǒng)進化分析

為了明確9種真菌中BBP 的進化關(guān)系，本研究利用MEGA 7.0.26 軟件對這9種真菌的BBP 進行氨基酸序列多重比對分析并繪制系統(tǒng)進化樹。由圖2 可知，9種真菌BBP 的進化樹分支置信度為55～100，數(shù)值較高，表明該進化樹可信，其中，XP_003709462.1 和 XP_009226994.1、RKK80992.1和KLO90296.1 遺傳距離相近，說明兩兩之間同源性較高，親緣關(guān)系較近；ONH80283.1 與CCO28600.1分別獨立構(gòu)成一個分支，表明這二者與其他蛋白的同源性較低，親緣關(guān)系較遠，可能經(jīng)歷了不同的分子進化過程。

2.6 BBP 的三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)功能與其高級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為了進一步明確9種真菌中BBP 的生物學功能，本研究利用ExPASy中的Swiss Model 在線軟件對BBP 進行三級結(jié)構(gòu)預測獲取3D 結(jié)構(gòu)圖以及相關(guān)信息。由表4 可知，XP_008603189.1 和CCO28600.1 模板為4wan.1.A，其余7種真菌中BBP 模板均為4wal.1.A，其中，ONH80283.1與模板的一致性最高，達97.66%，建模質(zhì)量評分最高為0.23，建模質(zhì)量評分表示為0～1 之間的數(shù)字，數(shù)字越大可靠性越高，由此可知，該模型具有較高參考價值。由圖3可知，XP_003709462.1、XP_009226994.1、XP_961266.1、TDZ21617.1、XP_008603189.1、RKK80992.1以及KLO90296.1 的3D 結(jié)構(gòu)非常相似，推測BBP 在這7種真菌中高度結(jié)構(gòu)保守，功能相似；ONH80283.1 分子量最小，結(jié)構(gòu)相對較簡單，而CCO28600.1 以四聚體形式存在，推測其可能以四聚體形式發(fā)揮功能，這與系統(tǒng)進化分析中ONH80283.1 與CCO28600.1 獨立構(gòu)成分支的結(jié)果具有一致性。

2.7 BBP 的磷酸化與SUMO 化位點預測

磷酸化和SUMO 化是蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾內(nèi)容，在蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學功能上具有重要作用。本研究通過DISPHOS 1.3 在線軟件與GPS-SUMO 1.0 軟件分別預測了BBP 的磷酸化位點和SUMO 化位點。由表5 可知，RKK80992.1 與KLO90296.1 同為鐮刀菌屬，二者的Ser、Thr 和Tyr 3種氨基酸磷酸化位點占比極其相近；TDZ21617.1、XP_008603189.1、RKK80992.1 和KLO90296.1 具有1 個SUMO 化位點，XP_003709462.1、ONH80283.1、XP_009226994.1和XP_961266.1 均具有2 個SUMO 化位點或SUMO互作基序，而CCO28600.1 具有4 個SUMO 化位點或SUMO 互作基序。

表4 9種真菌中BBP 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)比對分析與質(zhì)量評價

3 討論與結(jié)論

基于剪接過程對于基因表達和蛋白質(zhì)多樣性的重要影響，剪接位點識別輔助因子的研究成為基因表達調(diào)控的重要內(nèi)容之一。已有大量研究表明，BBP在人（Homo sapiens）[15]、小家鼠（Mus musculus）[16-17]、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[18]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster） 和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）[19]細胞的可變剪接中起著至關(guān)重要的作用。近年來也有學者針對BBP 的分子功能在植物中展開研究，例如JANG 等[20]研究表明，在擬南芥中BBP 是部分pre-mRNA 選擇性剪接過程必不可少的參與者，缺少BBP 會導致擬南芥發(fā)育異常；YIN 等[21]在桃的花色研究中表明，BBP 作為一種重要的蛋白質(zhì)參與了pre-mRNA 的選擇性剪接，這種選擇性剪接導致紅色桃花中花青素合酶（ANS）活性明顯升高。在真菌中，對BBP 的功能研究主要圍繞釀酒酵母展開，研究表明，BBP 除了在剪接過程中發(fā)揮必要功能，還參與pre-mRNA 的核滯留[22-23]。RODGERS 等[24]從釀酒酵母細胞裂解物中分離出BBP進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)只有一部分BBP 分子能與RNA 底物互相作用，從而推測BBP 可能具有新的調(diào)節(jié)功能，進一步驗證了BBP 可能在選擇性剪接之外發(fā)揮功能。然而在其他真菌中對BBP 的功能研究鮮有報道。

表5 9種真菌中BBP 的磷酸化位點與SUMO 化位點

本研究對包括釀酒酵母在內(nèi)的9種常見真菌中的BBP 進行生物信息學分析，結(jié)果顯示，與其他真菌BBP 二級結(jié)構(gòu)相比，釀酒酵母ONH80283.1 的α螺旋占比最小，β 轉(zhuǎn)角占比最高，且結(jié)構(gòu)域整體靠近N 端，直接導致其三級結(jié)構(gòu)與其他真菌形成明顯差異。值得注意的是，立枯絲核菌CCO28600.1 的三級結(jié)構(gòu)以四聚體的形式存在，且含有4 處SUMO 化位點。這些都與系統(tǒng)進化分析中，ONH80283.1 和CCO28600.1 各自獨立構(gòu)成分支相符。由此推測，釀酒酵母和立枯絲核菌中的BBP 發(fā)揮的功能并不完全相同或在發(fā)揮功能的方式上有所不同。此外，RKK80992.1 與KLO90296.1 同為鐮刀菌屬，這兩種真菌中BBP 的理化性質(zhì)極其相似，二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域及三級結(jié)構(gòu)差異極小，系統(tǒng)進化分析中其親緣關(guān)系最近，且二者Ser、Thr、Tyr 3種氨基酸磷酸化位點占比相近，同有一處SUMO 化位點，由此可見，BBP在同屬真菌中進化高度保守。