蘇立乾 孟宏學(xué)

原發(fā)性睪丸淋巴瘤(PTL)是一種易中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)、腫瘤相關(guān)致死率高的腫瘤，預(yù)后較差[1]。目前臨床上缺少早期預(yù)測(cè)PTL中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的指標(biāo)，這也長(zhǎng)期制約著原發(fā)性睪丸淋巴瘤的治療進(jìn)展與患者的預(yù)后[2]。以往的研究提示趨化因子受體CXCR4與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)水平可能與淋巴瘤的中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)有關(guān)[3-4]，因此本研究運(yùn)用了免疫組化方法對(duì)PTL患者的組織切片中兩種蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，并且探討了CXCR4和VEGF與PTL患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

59例原發(fā)性睪丸淋巴瘤組織選自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2000年1月—2015年12月手術(shù)切除標(biāo)本或穿刺病理標(biāo)本，且均已簽署知情同意書(shū)，病理類型經(jīng)病理科醫(yī)生確診均為非霍奇金彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。確診前均未接受化療、放療或其它抗腫瘤治療。患者均為男性，年齡32～85歲，中位年齡54歲；組織學(xué)分類中生發(fā)中心來(lái)源(GCB)10例，非生發(fā)中心來(lái)源(Non-GCB)49例；臨床病理相關(guān)資料包括年齡、部位、病理類型、ECOG評(píng)分、血清乳酸脫氫酶(LDH)、β2微球蛋白、Ki67(結(jié)果來(lái)自本院病理報(bào)告)、淋巴結(jié)外累及情況、淋巴瘤國(guó)際預(yù)后指數(shù)(International prognostic index，IPI)評(píng)分、Ann Arbor分期、治療方法、是否完全緩解(Complete rremission，CR)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)間、部位及生存情況。

1.2 研究方法及結(jié)果判定

1.2.1 研究?jī)x器和試劑 光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)購(gòu)自上海Olymous公司，TEC-2601型攤片機(jī)購(gòu)自常州市郝思林醫(yī)用儀器有限公司，切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Microm公司，切片盒購(gòu)自哈爾濱市博潤(rùn)生物技術(shù)公司，恒溫干燥箱購(gòu)自上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。兔抗人單克隆CXCR4抗體[UMB2](Ab124824，dilution 1∶100，Cambridge，UK)、鼠抗人單克隆VEGF抗體[VG-1](Ab1316，dilution 1∶200，Cambridge，UK)購(gòu)自Abcam公司，增強(qiáng)型二步法檢測(cè)試劑盒、DAB顯色劑、PBS磷酸鹽緩沖、免疫組化S-P試劑盒、中性樹(shù)膠等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 研究方法和結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)具體操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，以已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照(試劑公司提供)，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照。采用Olympus顯微鏡觀察組織切片染色情況。CXCR4及VEGF蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或者褐色顆粒的細(xì)胞記為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野，將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘為綜合評(píng)分：(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(3)將陽(yáng)性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度相乘結(jié)果為：≥6分為陽(yáng)性，<6分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件22.0版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CXCR4、VEGF與臨床病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)分析；應(yīng)用Kaplan-Meier方法對(duì)CXCR4、VEGF表達(dá)情況進(jìn)行生存分析；應(yīng)用Cox回歸模型進(jìn)行預(yù)后分析；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4和VEGF的表達(dá)水平

CXCR4及VEGF蛋白在原發(fā)性睪丸淋巴瘤患者組織細(xì)胞中均有表達(dá)，但主要出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。59例PTL患者中，有31例患者CXCR4蛋白表達(dá)陽(yáng)性(52.5%)，21例患者VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性(35.6%)(圖1)。

圖1 CXCR4和VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況Figure 1 The high expression of CXCR4 and VEGF in PTL tumor tissuesNote：A.The expression of CXCR4 in PTL tumor tissues(200×)；B.The expression of CXCR4 in PTL tumor tissues(400×)and IHC score(9)；C.The expression of VEGF in PTL tumor tissues(200×)；D.The expression of VEGF in PTL tumor tissues(400×)and IHC score(12).

2.2 CXCR4和VEGF的表達(dá)與原發(fā)性睪丸淋巴瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

CXCR4蛋白的表達(dá)與Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、血清LDH水平、Ki67密切相關(guān)。CXCR4蛋白隨患者Ann Arbor分期的增加表達(dá)增強(qiáng)(P<0.001)；IPI評(píng)分高的患者CXCR4蛋白表達(dá)增加(P=0.004)；CXCR4蛋白在血清LDH水平高的患者中高表達(dá)(P=0.004)；CXCR4蛋白的表達(dá)與Ki67有關(guān)(P=0.006)；其與患者年齡、部位、組織學(xué)來(lái)源、β2微球蛋白、復(fù)發(fā)狀態(tài)等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。

VEGF蛋白的表達(dá)與Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、B癥狀、血清LDH水平、是否復(fù)發(fā)、CR狀態(tài)密切相關(guān)。VEGF蛋白隨患者Ann Arbor分期的增加表達(dá)增多(P=0.014)；IPI評(píng)分高的患者VEGF蛋白表達(dá)增加(P<0.001)；VEGF蛋白在有B癥狀的患者中高表達(dá)(P=0.008)；VEGF蛋白的表達(dá)在血清LDH水平高的患者中表達(dá)增高(P<0.001)；復(fù)發(fā)的患者VEGF表達(dá)較未復(fù)發(fā)的患者表達(dá)增高(P<0.001)；VEGF蛋白在獲得CR的患者中較未獲得CR的患者中表達(dá)弱(P<0.001)；除此之外VEGF蛋白的表達(dá)與患者的年齡、發(fā)病部位、ECOG評(píng)分、組織學(xué)來(lái)源、Ki67等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 原發(fā)性睪丸淋巴瘤的臨床病理特征及與CXCR4、VEGF表達(dá)的關(guān)系

2.3 CXCR4和VEGF在原發(fā)性睪丸淋巴瘤中表達(dá)的關(guān)系

在本實(shí)驗(yàn)59例原發(fā)性睪丸淋巴瘤組織中，二者在原發(fā)性睪丸淋巴瘤中的表達(dá)存在相關(guān)性(φ=0.423，P=0.001)(表2)。

表2 原發(fā)性睪丸淋巴瘤中CXCR4與VEGF表達(dá)的關(guān)系

2.4 CXCR4和VEGF與原發(fā)性睪丸淋巴瘤預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達(dá)高的患者較表達(dá)低的患者PFS與OS更差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021，P=0.031)(圖2)，VEGF表達(dá)高的患者PFS與OS均更差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3)，提示CXCR4和VEGF表達(dá)高的患者預(yù)后較差。

圖2 CXCR4蛋白表達(dá)強(qiáng)度的PFS和OS生存曲線Figure 2 PFS and OS curve for the CXCR4 expression

圖3 VEGF蛋白表達(dá)強(qiáng)度的PFS和OS生存曲線Figure 3 PFS and OS curve for the VEGF expression

通過(guò)Cox單因素分析，結(jié)果顯示Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、B癥狀、血清LDH水平、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)受累、CR狀態(tài)、CXCR4及VEGF表達(dá)等因素與預(yù)后相關(guān)，陽(yáng)性患者的PFS和OS更短(P<0.05)；Cox多因素分析結(jié)果提示CR狀態(tài)、CXCR4及VEGF表達(dá)等因素是影響PTL患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)(表3，表4)。

表3 影響原發(fā)性睪丸淋巴瘤PFS預(yù)后的單因素和多因素分析

表4 影響原發(fā)性睪丸淋巴瘤OS預(yù)后的單因素和多因素分析

2.5 CXCR4和VEGF表達(dá)與原發(fā)性睪丸淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的關(guān)系

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是原發(fā)性睪丸淋巴瘤常見(jiàn)的受累部位，患者預(yù)后差。本研究分析了CXCR4與VEGF蛋白的表達(dá)與原發(fā)性睪丸淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的關(guān)系。59例患者中11例在隨訪期間出現(xiàn)了CNS受累，而受累的11例患者中，10例CXCR4均高表達(dá)，9例VEGF蛋白高表達(dá)。由此可見(jiàn)，CNS受累的患者CXCR4與VEGF蛋白兩者均明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005，P=0.001)(表5)。

表5 CXCR4與VEGF蛋白的表達(dá)與原發(fā)性睪丸淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的關(guān)系

3 討論

我國(guó)原發(fā)性睪丸淋巴瘤發(fā)病率正在逐年增加，并逐漸有年輕化的趨勢(shì)[5]。PTL具有明顯的結(jié)外侵犯趨勢(shì)，常常侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)及對(duì)側(cè)睪丸等區(qū)域，不能盡早發(fā)現(xiàn)以及采取預(yù)防措施，患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，從而影響其治療效果和預(yù)后[6]。因?yàn)椴±碓\斷患者數(shù)量的增多，在臨床上，對(duì)這一類少見(jiàn)的淋巴瘤類型也越發(fā)引起重視。目前尚無(wú)針對(duì)原發(fā)性睪丸淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，因此尋求具有提示作用的生物標(biāo)記分子，針對(duì)高?；颊呒霸珙A(yù)防治療，研發(fā)針對(duì)目標(biāo)靶向的藥物顯得尤為重要。

PTL發(fā)病率較低，所以關(guān)于它的大多數(shù)可用的研究數(shù)據(jù)均來(lái)自小型回顧性或非隨機(jī)化的研究。一項(xiàng)基于人群的回顧性研究表明，5年和10年P(guān)TL無(wú)病生存率分別為62%和50%。同樣，在以往的國(guó)際結(jié)外淋巴瘤研究組(IELSG)的回顧性研究中，患者的5～10年的無(wú)進(jìn)展生存率分別為48%和33%。對(duì)于PTL，CNS浸潤(rùn)是一種較為嚴(yán)重的并發(fā)癥[7]。據(jù)報(bào)道，CNS受累可發(fā)生在2%至8%的患者中，且平均復(fù)發(fā)時(shí)間較短，一般5～12個(gè)月。同時(shí)，發(fā)生CNS浸潤(rùn)的患者，中位生存期一般為2至5個(gè)月[8]。因此，對(duì)于CNS受累高風(fēng)險(xiǎn)的患者早期診斷及干預(yù)顯得非常重要。然而，目前并沒(méi)有確切的分子生物標(biāo)志物用于識(shí)別PTL患者CNS受累高?；颊?。

近年研究證實(shí)了CXCR4在血液系統(tǒng)腫瘤中，有促腫瘤生長(zhǎng)作用[9]。除血液系統(tǒng)外，包括外周非霍奇金淋巴瘤(NHL)，CXCLl2與其受體CXCR4在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)，例如肺，腦和乳腺癌等[10]。之前也有臨床模型表明，腫瘤的定向轉(zhuǎn)移與CXCR4的活化及向CXCR12表達(dá)的靶器官遷移的調(diào)節(jié)有關(guān)[11]。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，CXCL12趨化因子介導(dǎo)肺癌細(xì)胞向腦遷移的受體激活ERK，這又反過(guò)來(lái)激活了IKKa/B和NF Rb信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致了整合素的激活(ITGB1和ITGB3)[12]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)高度特異性，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，VEGF還可促進(jìn)了特異性趨化因子CXCLl2的遷移[13]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌中的VEGF介導(dǎo)的信號(hào)通路，VEGFR1表達(dá)水平與腦轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且VEGFR1信號(hào)是由胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移而進(jìn)行介導(dǎo)的[14]。

在本研究中我們?nèi)〉昧祟愃频慕Y(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)CXCR4和VEGF蛋白高表達(dá)與低表達(dá)相比，患者的PFS和OS更差，且差異顯著。我們的研究報(bào)告提出，這兩種蛋白高表達(dá)也與PTL其他危險(xiǎn)因素有關(guān)，如高IPI分級(jí)、血清LDH水平升高，發(fā)生復(fù)發(fā)的晚期腫瘤等，這表明這兩種蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。特別需要指出的是，本研究發(fā)現(xiàn)CNS受累與CXCR4和VEGF的表達(dá)有關(guān)，他們可能是在未經(jīng)治療的PTL患者CNS受累的重要預(yù)測(cè)因素。

以往的研究中有關(guān)CNS浸潤(rùn)的患者在臨床上表現(xiàn)的高危險(xiǎn)因素，如血清LDH升高，結(jié)外累及，骨髓受累等，但這些因素缺乏特異性[15]。腦脊液細(xì)胞學(xué)/流式細(xì)胞術(shù)是一種很好的診斷方法，但是由于操作成本高，而不被大多數(shù)患者所接受，除此之外，這種篩選方法敏感性低，只有大約50%CNS受累可以提早被檢測(cè)出[16]。除了上述診斷方法，CT影像學(xué)和MRI磁共振成像也是診斷的一個(gè)重要的方法，但是它們不能對(duì)CNS受累進(jìn)行預(yù)測(cè)，只有在復(fù)發(fā)已經(jīng)發(fā)生時(shí)才能檢出[17]。本研究發(fā)現(xiàn)90.9%(10/11例)的CNS受累患者CXCR4蛋白高表達(dá)、81.8%的CNS受累患者VEGF蛋白高表達(dá)，提示其對(duì)CNS受累的預(yù)測(cè)具有極高的敏感性。由于樣本量小，我中心數(shù)據(jù)較其他已報(bào)道的數(shù)據(jù)有差異，但有一定的指導(dǎo)意義。更重要的是，這兩個(gè)蛋白的高表達(dá)可以在病理診斷的早期進(jìn)行檢測(cè)并且對(duì)CNS受累進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)這部分高?；颊哌M(jìn)行早期的預(yù)防性治療如鞘內(nèi)化療、全腦放療或CXCR4和VEGF的分子靶向等治療。一些研究者指出，抑制CXCR4和VEGF兩種蛋白的活性作為潛在的治療靶點(diǎn)可能會(huì)成為未來(lái)治療PTL更好的治療策略。

綜上所述，我們的研究表明，趨化因子CXCR4對(duì)于中樞受侵具有很強(qiáng)的趨化作用，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF可增強(qiáng)腫瘤的侵襲性，為其在中樞受侵方面的機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)；CXCR4、VEGF蛋白高表達(dá)的患者具有較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)，因此可作為預(yù)測(cè)指標(biāo)，針對(duì)高表達(dá)的這部分患者提前做好預(yù)防措施，進(jìn)而可改善患者的預(yù)后；并且這兩種蛋白可作為兩個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，為原發(fā)性睪丸淋巴瘤的臨床治療提供更好的治療選擇。