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水稻黃葉突變體yl6(t)的遺傳分析和基因定位探究

2020-08-19 13:00:03袁鎧
南方農(nóng)業(yè)·中旬 2020年6期
關(guān)鍵詞:水稻

袁鎧

摘 要 在粳稻品種日本晴群體中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)黃葉自然突變體yl6(t),因此,對(duì)其進(jìn)行調(diào)查研究。農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn),與野生型相比,yl6(t)的結(jié)實(shí)率明顯較低;葉綠素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),突變體yl6(t)苗期后期葉素綠含量極顯著降低,全生育期為黃葉;超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),葉綠體形態(tài)改變,類囊體片層結(jié)構(gòu)減少;遺傳分析表明,yl6(t)黃葉表型為單隱性核基因控制,利用SSR標(biāo)記將目的基因初步定位在水稻第6號(hào)染色體約56 kb區(qū)段內(nèi),該區(qū)段未有相關(guān)基因報(bào)道,推測(cè)是1個(gè)新的控制水稻葉色的基因。

關(guān)鍵詞 水稻;黃葉突變體;遺傳分析;基因定位

水稻(Oryza sativa L.)是世界上三大糧食作物之一,中國(guó)絕大多數(shù)人口以水稻為主食。隨著人口的增加和環(huán)境的惡化,提高水稻的產(chǎn)量顯得十分重要。水稻產(chǎn)量的95%來(lái)自葉片葉綠體的光合作用,葉片是植物光合作用的主要器官。因此,研究水稻的葉色有重要的意義。

本研究對(duì)從日本晴群體中發(fā)現(xiàn)的自然突變的黃葉突變體進(jìn)行了農(nóng)藝性狀考察,對(duì)其進(jìn)行遺傳分析和基因初步定位,為進(jìn)一步精細(xì)定位和克隆該基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃葉突變體由粳稻日本晴經(jīng)自然突變而來(lái),暫命名為yl6(t),該突變體經(jīng)多年種植發(fā)現(xiàn)突變性狀能穩(wěn)定遺傳。其他水稻材料包括正常葉色粳稻品種日本晴和秈稻品種Kasalath。親本材料種植于揚(yáng)州大學(xué)水稻試驗(yàn)田,遺傳分析和定位群體種植于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院酒甸實(shí)驗(yàn)基地,均按照常規(guī)水肥管理。

1.2 葉綠素含量測(cè)定

于苗期、分蘗期及成熟期分別測(cè)定突變體yl6(t)和野生型日本晴的葉綠素含量。各取3株的倒2葉設(shè)定生物學(xué)重復(fù),稱取伸展完全的鮮葉(去葉脈)0.2 g。參照Lichtenthaler等的方法[1],用分光光度計(jì)分別測(cè)定664 nm、646 nm、470 nm波長(zhǎng)處的吸光值D,進(jìn)行葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素含量測(cè)定。

1.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

在水稻苗期、分蘗期分別取突變體yl6(t)與野生型日本晴的葉片,在1~3 min取樣,用刀片切成2 mm×2 mm的矩形小片,經(jīng)過(guò)生物公司處理制成超薄切片,觀察突變體和野生型葉肉細(xì)胞的葉綠體形態(tài)并拍照[2]。

1.4 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查與分析

成熟期分別隨機(jī)選取兩親本各6株,統(tǒng)計(jì)其劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、有效穗數(shù)、飽粒數(shù)、總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、主穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒重、株高,計(jì)算平均值,進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)。

1.5 遺傳分析群體和基因定位群體構(gòu)建

以正常日本晴為父本與突變體yl6(t)進(jìn)行雜交得到F1,自交獲得F2,以F2為遺傳分析群體。以Kasalath為父本與突變體yl6(t)雜交F1,自交獲得F2,從F2中分離黃葉表型的單株作為基因定位群體。

1.6 突變體yl6(t)的基因定位

采用BSA法,建成黃葉突變池和正常池。利用SSR標(biāo)記對(duì)兩個(gè)親本突變體yl6(t)與Kasalath進(jìn)行多態(tài)性分析,利用多態(tài)性良好的標(biāo)記分析親本及池間的多態(tài)性,找出與目的基因可能連鎖的標(biāo)記,利用隱性黃葉群體進(jìn)行驗(yàn)證,確定目標(biāo)基因所在染色體。

根據(jù)目標(biāo)基因所在的位置,設(shè)計(jì)STS標(biāo)記并挑選出多態(tài)性良好的標(biāo)記,利用突變體yl6(t)與Kasalath的F2群體中的1 430株黃葉突變單株進(jìn)行精細(xì)定位,DNA的提取采用CTAB法。

PCR反應(yīng)過(guò)程:94 ℃,5 min預(yù)變性;95 ℃,40 s變性;51~56 ℃,40 s退火;72 ℃,40 s延伸,35個(gè)循環(huán)(潮霉素30個(gè)循環(huán));72 ℃,10 min;16 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體yl6(t)的表型特征

通過(guò)觀察種植在揚(yáng)州的野生型日本晴和突變體yl6(t)可以明顯發(fā)現(xiàn),與野生型日本晴相比,突變體yl6(t)在苗期后期表現(xiàn)為淡黃葉,生長(zhǎng)期間不轉(zhuǎn)綠,成熟期時(shí)植株葉色已明顯黃于野生型。突變體株高較矮,分蘗較少。

突變體yl6(t)與野生型日本晴相比,農(nóng)藝性狀也有所改變,具體見(jiàn)表1。兩者二次枝梗數(shù)、主穗長(zhǎng)有顯著差異,株高、千粒質(zhì)量達(dá)到了極顯著差異,其他農(nóng)藝性狀差異不顯著。

2.2 突變體yl6(t)的葉綠素含量測(cè)定

用紫外線分光光度計(jì)分別測(cè)量了突變體yl6(t)和野生型日本晴葉片各時(shí)期的葉綠素含量。發(fā)現(xiàn)突變體yl6(t)苗期和分蘗期葉綠素含量均低于野生型日本晴。隨著葉片的生長(zhǎng),突變體葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量都極顯著下降,而胡蘿卜素含量顯著下降,這說(shuō)明突變體yl6(t)葉片變黃有可能是葉綠素含量減少導(dǎo)致的。

2.3 突變體yl6(t)的葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):,與野生型日本晴相比,突變體yl6(t)的葉綠體形狀不規(guī)則,內(nèi)部含有嗜餓性板層小體,類囊體數(shù)量減少,說(shuō)明葉綠體發(fā)育不正常。這些說(shuō)明,突變體yl6(t)與野生型日本晴相比,不僅葉綠素含量有差異,葉綠體的發(fā)育情況也受到了影響,這些可能與葉色變異有關(guān)。

2.4 突變體yl6(t)的遺傳分析與基因定位

以突變體yl6(t)為母本,與正常葉色日本晴雜交,F(xiàn)1代自交獲得F2,在F2代中,苗期后期發(fā)生葉色的性狀分離。隨機(jī)調(diào)查500株,考察突變株和正常株數(shù)量,其中突變株數(shù)量為109株,正常株數(shù)量為391株,X2=2.56<3.84=X20.05,該結(jié)果符合孟德?tīng)枂位蚍蛛x比3∶1,證明黃葉突變體yl6(t)受一對(duì)隱性核基因控制。

利用480個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性分析,利用多態(tài)性較好的標(biāo)記檢測(cè)混池的多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)標(biāo)記RM5851有明顯的多態(tài)性,位于6號(hào)染色體上,接著利用RM5851對(duì)隱性單株群體進(jìn)行群體驗(yàn)證,跑膠發(fā)現(xiàn)突變體的帶型與大部分隱性單株的帶型相同,經(jīng)過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)這個(gè)標(biāo)記與目的基因的交換率約為10%,初步確定該黃葉基因位于第6號(hào)染色體上。為了進(jìn)一步定位該黃葉基因,在標(biāo)記RM5851附近發(fā)展了十幾個(gè)標(biāo)記,最后挑選出多態(tài)性良好的IDL標(biāo)記:標(biāo)記ID1279、ID1413、ID1505、ID1732。因?yàn)檫€有一批黃葉隱性單株群體,為了嘗試進(jìn)一步縮小定位區(qū)間,于是接著利用480株黃葉突變單株進(jìn)行分析,將該基因定位于標(biāo)記ID1279與ID1732之間,接著繼續(xù)利用950株單株進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該基因與標(biāo)記ID1437共分離,且在標(biāo)記ID1432與標(biāo)記ID1505分別有12個(gè)和15個(gè)交換單株,標(biāo)記ID1413有18個(gè)交換單株,標(biāo)記ID1610有37株交換單株,標(biāo)記ID1499有13個(gè)交換單株,通過(guò)交換株個(gè)數(shù)的變化情況,表明該基因存在于標(biāo)記ID1432與標(biāo)記ID1499之間,物理距離約為56 kb。

3 結(jié)論與討論

本研究中所采用的材料為自然突變而來(lái)的黃葉突變體,突變方式較為安全,經(jīng)過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn):突變體yl6(t)的農(nóng)藝性狀發(fā)生了變化,葉綠素含量與野生型相比明顯降低,葉綠體產(chǎn)生了變異、結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。因此該黃葉突變體葉色發(fā)生變異可能是由于葉綠素含量變化和葉綠體發(fā)育異常共同引起的。

本研究將yl6(t)基因定位到水稻6號(hào)染色體56 kb區(qū)段內(nèi),該區(qū)段中未見(jiàn)有關(guān)黃葉基因的有關(guān)報(bào)道,因此推測(cè)yl6(t)是一個(gè)新的黃葉基因,對(duì)該基因進(jìn)一步研究將有利于闡明水稻葉色變異的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn):

[1] Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes[J].Methods in enzymology,1987,148C:350-382.

[2] 邱義蘭,李紅,彭克勤,等.水稻“斑馬葉”突變體B411葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察[J].作物學(xué)報(bào),2010,36(1):184-190.

(責(zé)任編輯:趙中正)

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