謝澤宇， 陳水玲， 楊志華， 阮子靜， 黃新河

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

毛蘭素(Erianin)， 2-Methoxy-5-[2-(3,4,5-trimethoxy-phenyl)-ethyl]-phenol，是一種提取自名貴中藥材鐵皮石斛和鼓槌石斛的天然小分子化合物， 分子量為318.36[1]。除石斛外，在毛蘭屬植物Eriacarinata中也能分離純化得到毛蘭素[2]。中醫(yī)臨床上常將毛蘭素作為解熱劑和鎮(zhèn)痛劑使用。近期研究表明毛蘭素可誘導(dǎo)包括肝癌[3]、胃癌[4]、膀胱癌[5]、結(jié)腸癌[6]、白血病[7]、黑色素瘤[3]、骨肉瘤[8]、宮頸癌[9]及鼻咽癌[10]等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡或自噬和抗血管生成作用[11]。

丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase, PC)是生物素依賴性酶家族成員[12]。哺乳動(dòng)物丙酮酸羧化酶是由4個(gè)相同亞基組成的四聚體，每個(gè)亞基有1178個(gè)氨基酸[13]。丙酮酸羧化酶可通過(guò)兩步反應(yīng)催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸[12]。PC催化的丙酮酸羧化將確保TCA循環(huán)中間體介導(dǎo)的生物合成在癌癥增殖期間不受限制[14]。

敲低PC的表達(dá)顯著降低細(xì)胞天冬氨酸水平，進(jìn)而影響核苷酸的生物合成并限制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。對(duì)其抑制能阻斷非小細(xì)胞肺癌NSCLC細(xì)胞在小鼠肺組織中誘導(dǎo)腫瘤形成的能力[16]。

毛蘭素處理與PC基因的沉默在抑制癌細(xì)胞增殖、改善糖尿病癥狀和對(duì)抗微生物感染方面有十分相似的作用[3-11, 15-22]。因此，我們推測(cè)毛蘭素可能通過(guò)PC對(duì)癌細(xì)胞增殖，糖尿病和微生物感染等產(chǎn)生影響。

本研究采用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬預(yù)測(cè)了毛蘭素與hPC的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合強(qiáng)弱，并利用體外線粒體蛋白孵育實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)毛蘭素對(duì)PC酶活性的影響。綜合兩部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容探索毛蘭素是否為丙酮酸羧化酶(PC)底物，以期為深入研究毛蘭素的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 序列信息與軟件

hPC蛋白的序列信息來(lái)自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)；Discovery Studio 2016 v16.1藥物發(fā)現(xiàn)與生物大分子計(jì)算模擬軟件購(gòu)自BIOVIA；Blast數(shù)據(jù)庫(kù)為PDB_nr95。

1.1.2 細(xì)胞株與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC(American Type Culture Collection)，由西南交通大學(xué)衰老與代謝實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)與保藏；DMEM高糖培養(yǎng)基，小牛血清，胰蛋白酶，Antibiotic-antimycotic試劑均購(gòu)自Gibco公司，其中小牛血清經(jīng)56 ℃水浴滅活30 min，-20 ℃保存；二甲基亞砜，毛蘭素購(gòu)買自百靈威科技有限公司；丙酮酸羧化酶檢測(cè)試劑購(gòu)自Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 同源建模

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢需要建模的hPC(human pyruvate carboxylase)蛋白的氨基酸序列，在Discovery Studio 2016 v16.1軟件中新建hPC的蛋白質(zhì)序列文件。使用protocol里sequence analysis中的BLAST Search模塊，在PDB_nr95數(shù)據(jù)庫(kù)中查找hPC的同源蛋白。選擇同源性較高的一個(gè)或多個(gè)蛋白作為模板，將模板序列添加到hPC序列窗口中，使用Align Multiple Sequence protocol進(jìn)行序列比對(duì)。Load模板結(jié)構(gòu)，使用Homology Building protocol進(jìn)行同源建模。

1.2.2 分子對(duì)接

利用Discovery Studio 2016 v16.1 的Clean Protein工具去除蛋白冗余構(gòu)象，補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基，為蛋白加氫。利用From Receptor Cavities 模塊定義受體hPC蛋白的活性位點(diǎn)。利用Sketching 工具，構(gòu)建毛蘭素小分子的初始結(jié)構(gòu)，Clean Geometry進(jìn)一步構(gòu)建毛蘭素的幾何三維結(jié)構(gòu)。利用Dock Ligands(LibDock)工具執(zhí)行分子對(duì)接計(jì)算，Ligand Interactions觀察對(duì)接pose的非鍵相互作用。Define Ligand并Show 2D Diagram打開毛蘭素-PC蛋白相互作用的二維平面圖，更直觀的觀察二者的相互作用及關(guān)鍵的氨基酸和化學(xué)基團(tuán)。

1.2.3 hPC活性檢測(cè)

收集5×106個(gè)HepG2細(xì)胞，使用移液器加入1 mL 提取液，用冰浴研缽勻漿。將細(xì)胞勻漿600 r/min，4 ℃離心5 min。棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11 000 r/min，4 ℃離心10 min。使用移液器在沉淀中加入1 mL 提取液，超聲波破碎(冰浴，功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)[23]。線粒體提取液與不同濃度的毛蘭素37 ℃孵育1 h后，用于PC活性測(cè)定。

將丙酮酸、ATP、NaHCO3、蘋果酸脫氫酶、NADH和乙酰CoA混合溶解待用；置于37 ℃預(yù)熱5 min。在1 mL 石英比色皿中使用移液器加入50 μL 樣品，950 μL工作液，立即混勻，記錄340 nm 處初始吸光值A(chǔ)1 和2 min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。每mg 組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。按公式PC(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr(ΔA：吸光值改變，V反總：反應(yīng)體系總體積，ε：摩爾吸光系數(shù)，d：液層厚度，V樣：樣品體積，Cpr：樣品蛋白濃度)計(jì)算hPC酶活[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 hPC的同源建模

hPC是由1178 個(gè)氨基酸殘基組成的線粒體代謝酶，由于目前尚未確定hPC的N-末端結(jié)構(gòu)[25]，所以我們使用Discovery Studio 2016 v16.1將hPC序列在PDB_nr95數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了BLAST Search(圖1)，找到了3個(gè)E-value值(越小同源性越高)為0的蛋白質(zhì)序列(表1)，選擇其中整體同源性最高的sPC(StaphylococcusAureusPyruvate Carboxylase)為模板，使用homology modeling模塊進(jìn)行同源建模，用Molprobity分析并優(yōu)化后得到hPC蛋白結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 hPC序列的BLAST Search

2.2 hPC的預(yù)處理與活性位點(diǎn)定義

將同源建模得到的hPC蛋白結(jié)構(gòu)文件用Discovery Studio 2016 v16.1打開，并去除水分子后，用Macromolecules模塊中的工具去除蛋白冗余構(gòu)象，補(bǔ)充非完整氨基酸殘基，并為hPC蛋白加氫。然后使用From Receptor Cavities定義了共116個(gè)蛋白活性位點(diǎn)，以尋找毛蘭素可能的結(jié)合部位。

2.3 hPC蛋白與毛蘭素的分子對(duì)接

利用LibDock將毛蘭素分別與各個(gè)活性位點(diǎn)對(duì)接，有48個(gè)蛋白活性位點(diǎn)能與毛蘭素產(chǎn)生較穩(wěn)定的pose，其中能產(chǎn)生Libdockscore大于75 pose的site有28個(gè)，大于100的有6個(gè)(圖3)。表明毛蘭素可能在多個(gè)活性位點(diǎn)處與hPC蛋白結(jié)合。

表1 hPC序列的BLAST Search

Libdock score最高的兩個(gè)site中的毛蘭素小分子分別位于四聚體蛋白的BC鏈和AD鏈的界面處(圖 3)，化學(xué)環(huán)境幾乎一樣。hPC蛋白通過(guò)天冬氨酸殘基的常規(guī)氫鍵與π-陰離子互作，甲硫氨酸殘基的π-二硫鍵和π-烷基互作以及天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和賴氨酸殘基的碳?xì)錃滏I與毛蘭素形成了相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖2 hPC蛋白結(jié)構(gòu)的同源模型

圖3 hPC與毛蘭素對(duì)接Libdockscore分布(A)，毛蘭素在site 4/5處的pose(B)

圖4 hPC與毛蘭素的非鍵作用模型(A:3D; B:2D)

進(jìn)一步的CDOCKER分析表明，毛蘭素在site 4/5處的-CDOCKER INTERACTION ENERGY均大于167.44 kJ/mol，說(shuō)明毛蘭素與hPC蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)。這提示我們毛蘭素可能與hPC蛋白結(jié)合，從而抑制hPC的活性。

2.4 毛蘭素體外抑制實(shí)驗(yàn)

PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP 和Pi，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH 生成蘋果酸和NAD+，在340 nm下測(cè)定NADH 氧化速率，即可反映PC 活性[24]。

將肝癌HepG2細(xì)胞的線粒體蛋白提取液分別與不同濃度的毛蘭素孵育后，加入反應(yīng)底物以及激活劑乙酰-CoA，測(cè)定340 nm處吸光度的變化。每mg 線粒體蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位，由公式PC(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T計(jì)算得到PC活性。結(jié)果(圖5)顯示，毛蘭素可在體外顯著抑制線粒體提取物中的PC活性，表明毛蘭素可能與hPC蛋白非共價(jià)結(jié)合并影響其活性。

圖5 毛蘭素對(duì)線粒體PC活性的抑制作用

3 討論與結(jié)論

本研究以金黃色葡萄球菌的PC蛋白為模板，對(duì)人PC蛋白進(jìn)行同源建模，模擬hPC蛋白結(jié)構(gòu)，然后將石斛抗癌活性小分子毛蘭素與hPC對(duì)接。結(jié)果顯示，毛蘭素可在多個(gè)活性位點(diǎn)處與hPC蛋白結(jié)合，最佳結(jié)合位點(diǎn)位于四聚體蛋白的AD鏈界面與BC鏈界面上，Libdock score分別為128.51與129.79。在兩個(gè)化學(xué)環(huán)境幾乎相同的位點(diǎn)上，hPC通過(guò)常規(guī)氫鍵、碳?xì)錃滏I、π-陰離子互作、π-二硫鍵互作和π-烷基互作同毛蘭素結(jié)合，形成相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。CDOKER精準(zhǔn)對(duì)接結(jié)果也表明毛蘭素與hPC有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

丙酮酸羧化酶的催化過(guò)程為BC結(jié)構(gòu)域催化生物素轉(zhuǎn)化為羧基生物素，BCCP捕獲羧基生物素并使其耦連于四聚體結(jié)構(gòu)中心的空腔中，形成具有活性的PC/羧基生物素催化聚合物，CT結(jié)構(gòu)域則催化羧基生物素上的羧基轉(zhuǎn)移至丙酮酸生成草酰乙酸[26]。

BC與CT都是兩個(gè)單位的結(jié)構(gòu)域二聚化才具有催化活性，而根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，毛蘭素能結(jié)合在AD鏈與BC鏈形成的CT二聚體結(jié)構(gòu)域之間，可能改變了CT二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，影響其羧基轉(zhuǎn)移酶活性，使其無(wú)法完成最重要的一步催化過(guò)程，無(wú)法將羧基生物素上的羧基轉(zhuǎn)移至丙酮酸生成草酰乙酸，使催化反應(yīng)停留在生物素羧化這一步。毛蘭素的體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一推測(cè)，毛蘭素可在體外顯著抑制HepG2細(xì)胞線粒體提取液中的PC蛋白的活性，酶活性半抑制濃度IC50為128.16 nmol/L，與計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬結(jié)果相一致。

毛蘭素與PC蛋白的相互作用在一定程度上解釋了敲低PC表達(dá)與毛蘭素處理在癌細(xì)胞增殖[3-11, 16, 19-20]和糖尿病[12, 21]中的相似作用。同時(shí)，Blast Search結(jié)果中，金黃色葡萄球菌來(lái)源的PC蛋白與人PC蛋白同源性最高也一定程度上印證了毛蘭素對(duì)金黃色葡萄球菌感染的抵抗[18, 22]。

毛蘭素作為傳統(tǒng)中藥石斛中提取的小分子抗癌藥物，闡明其藥理毒理對(duì)其作為臨床藥物的研發(fā)與應(yīng)用有著重要意義。本研究證明了毛蘭素與hPC蛋白的相互作用，提示毛蘭素可能通過(guò)抑制線粒體回補(bǔ)，進(jìn)而抑制細(xì)胞生物合成代謝，影響癌細(xì)胞增殖。本研究為進(jìn)一步深入研究毛蘭素藥理毒理提供了一定參考和方向。