何 苗， 王 濤

(1. 中國科學(xué)院強磁場科學(xué)中心， 合肥 230031； 2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 科學(xué)島分院， 合肥 230026)

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的核酸蛋白復(fù)合體，維持染色體的穩(wěn)定和完整。正常細(xì)胞的端粒長度隨細(xì)胞分裂次數(shù)增長而逐漸變短，被稱作細(xì)胞分裂的“有絲分裂鐘”[1]。在大多數(shù)真核生物中，端粒DNA由5～8nt富含連續(xù)鳥嘌呤(G-rich)的串聯(lián)重復(fù)序列組成[2-3]，可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)由兩層或兩層以上的G-四分體通過π-π堆積形成，每個四分體又由Hoogsteen氫鍵將4個鳥嘌呤排列在一個環(huán)狀平面上所構(gòu)成。目前，已有研究表明真核生物端粒序列在體內(nèi)、體外均可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)[4-7]。該結(jié)構(gòu)可以通過阻止端粒酶和相關(guān)蛋白與端粒結(jié)合來抑制端粒延伸[8-9]，也可以作為端粒加帽結(jié)構(gòu)維持端粒的穩(wěn)定[6]。

Azzalin等報道端粒可以轉(zhuǎn)錄出具有GGGUUA重復(fù)序列的非編碼端粒RNA TERRA(Telomeric repeat-containing RNA)，并定位于端粒[10]，推翻了端粒區(qū)不能轉(zhuǎn)錄的傳統(tǒng)認(rèn)知。 隨后相繼有NMR和晶體學(xué)研究證明，TERRA自身也可以在體內(nèi)和體外形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)[11-15]，其同樣可以抑制端粒酶功能，并阻止染色體末端融合和細(xì)胞衰老[16]。

G-四鏈體可以由1條或多條獨立的DNA(或RNA)鏈形成[17]，所以在均含有連續(xù)鳥嘌呤串聯(lián)重復(fù)序列的端粒DNA和TERRA之間，存在形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物的可能性(圖1)。近年來已有報道通過點擊化學(xué)[18]和CD[19]等方法證明人源端粒區(qū)DNA和TERRA可以形成(2+2)分子間G-四鏈體復(fù)合物，這種復(fù)合物為TERRA提供了一種與端粒DNA相互作用的方式[20]。因此，研究端粒DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以為TERRA與端粒DNA的結(jié)合方式以及TERRA維持端粒穩(wěn)定性的方式提供新的見解。

A:3′-懸垂單鏈; B:DNA分子內(nèi)G-四鏈體; C: DNA-RNA G-四鏈體

除高等真核生物外，我們還以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(下稱賈第蟲)作為低等真核生物代表進(jìn)行研究。賈第蟲是最原始的單細(xì)胞真核生物，較其他低等真核生物有更高的進(jìn)化地位，因此具有更高的研究價值。賈第蟲端粒具有與人源端粒序列極為相似的GGGTA重復(fù)序列[21]，另有生物信息學(xué)研究表明其端粒區(qū)也可以轉(zhuǎn)錄出具有GGGUA重復(fù)序列的TERRA[22]。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗中使用的DNA由Sangon Biotech合成，RNA由TAKARA合成，具體序列如表1。

1.2 方法

所有實驗中，K+條件均為20 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)；Na+條件均為含100 mmol/L NaCl 的20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)。

表1 寡核苷酸序列

1.2.1 核磁共振實驗

將待測試核酸樣品溶于含10%重水的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中，95 ℃退火，在Bruker Ultrashield Plus 500 MHz核磁共振波譜儀上掃描一維氫譜。滴定實驗時，每次向原體系中加入樣品后立即進(jìn)行一維氫譜記譜。

1.2.2 膠遷移率實驗

將核酸樣品溶于20 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)中，95 ℃退火，用含20 mmol/L KCl的12%非變性膠進(jìn)行電泳檢測。電泳緩沖液為含20 mmol/L KCl的0.5×TBE，100 V恒壓電泳2 h。

1.2.3 圓二色光譜測試

在磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中配制核酸濃度為40 μmol/L的樣品，95 ℃退火，在室溫下掃描得到220～320 nm范圍內(nèi)的CD光譜。實驗在JASCO J-810 CD譜儀上進(jìn)行，比色皿光路長度為1 mm，最終譜圖扣除相應(yīng)緩沖液背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源端粒序列形成DNA-RNA分子間G-四鏈體復(fù)合物

G-四鏈體結(jié)構(gòu)核心部分的鳥嘌呤亞氨基質(zhì)子(H1)參與形成氫鍵，在一維氫譜10～12 ppm化學(xué)位移范圍內(nèi)呈現(xiàn)出特征譜峰[23]，所以通常通過該區(qū)域特征峰的出現(xiàn)來判斷G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。NZ117是含1個重復(fù)序列的人源端粒DNA片段，NZR61是含3個串聯(lián)重復(fù)序列的人源TERRA片段(表1)。K+條件下，NZ117在G-四鏈體特征峰區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)3個尖峰，表明其可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)(圖2-B：Ⅰ)；NZR61在該特征峰區(qū)域內(nèi)的譜峰堆疊嚴(yán)重，無單獨的尖峰出現(xiàn)，表明其形成多種G-四鏈體結(jié)構(gòu)(圖2-B：Ⅱ)；而(NZ117+NZR61)等摩爾混合體系的特征峰區(qū)域內(nèi)新出現(xiàn)了12個尖峰，與作為參照的NZ117和NZR61單獨存在時的特征峰分布不同，且參照物特征峰完全消失，表明NZ117和NZR61結(jié)合形成了新的分子間G-四鏈體復(fù)合物(圖2-B：Ⅲ)。以上NMR實驗結(jié)果表明，人源端粒DNA和TERRA之間可以緊密結(jié)合，形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物。

膠遷移率實驗發(fā)現(xiàn)，(NZ116+NZR61)混合體系的遷移率明顯不同于NZ117和NZR61自身的遷移率，表明NZ117和NZR61之間可以形成分子間新結(jié)構(gòu)(圖2-A)。膠圖中NZR61的條帶較寬且邊緣不清晰，是由于其形成多種結(jié)構(gòu)而使遷移率不同步(圖2-A：lane 1)。膠遷移率實驗結(jié)果與NMR一維氫譜結(jié)果一致，表明人源端粒DNA和TERRA之間的確可以形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物。

(NZ117 + NZR61)混合體系的一維氫譜譜峰分布總體較為分散，非常有利于應(yīng)用NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，但還需進(jìn)一步優(yōu)化譜圖。所以我們在288 K～320 K區(qū)間進(jìn)行了變溫實驗，觀察到譜峰的總體分布并未有明顯變化但曾經(jīng)重疊的譜峰可以在不同溫度下呈現(xiàn)分離狀態(tài)，說明NZ117與NZR61形成的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物在變溫區(qū)間依然保持著復(fù)合物折疊狀態(tài)，具有一定溫度范圍內(nèi)的生理熱穩(wěn)定性，以后的結(jié)構(gòu)解析工作中可以通過調(diào)控實驗溫度降低譜峰指認(rèn)難度(圖2-C)。

A：人源端粒序列膠遷移率實驗結(jié)果[泳道1：NZR61；泳道2：(NZR61+NZ117)混合體系；泳道 3：NZ117]。B：NZ117、NZR61和(NZ117+NZR62)混合體系的一維氫譜(6.6～12.2 ppm)， 310K。C：(NZ117+NZR61)混合體系的一維氫譜變溫實驗結(jié)果(6.4～9 ppm; 10.4～12.2 ppm)

2.2 賈第蟲端粒序列形成DNA-RNA分子間G-四鏈體復(fù)合物

NZ484和NZ116分別是含3個和1個串聯(lián)重復(fù)序列的賈第蟲端粒DNA片段，NZR2是與NZ116序列相當(dāng)?shù)馁Z第蟲TERRA片段(表1)。K+條件下，NZ484的G-四鏈體結(jié)構(gòu)特征峰區(qū)域內(nèi)無譜峰出現(xiàn)，表明其不形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)(圖3-A：Ⅰ)；NZ116和NZR2各自特征峰區(qū)域內(nèi)都有明顯的3個尖峰，但彼此分布的化學(xué)位移不同，表明二者各自均可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)(圖3-A：Ⅱ、Ⅳ)。而在(NZ484+NZ116)和(NZ484+NZR2)兩個混合體系中，特征峰區(qū)域均有新的尖銳譜峰出現(xiàn)但譜峰分布不同，且與NZ116和NZR2單獨存在時的譜峰分布也不相同，表明(NZ484+NZ116)和(NZ484+NZR2)兩個混合體系可以分別形成不同的分子間G-四鏈體復(fù)合物，且不同于NZ116和NZR2單獨的結(jié)構(gòu)(圖3-A：Ⅲ，Ⅴ)。

Na+條件下，NZ484和NZ116均無G-四鏈體特征峰出現(xiàn)，表明兩者均不形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)(圖3-B：Ⅰ、Ⅱ)；而(NZ484+NZ116)混合體系出現(xiàn)了G-四鏈體特征峰，表明NZ484和NZ116之間可以形成DNA-DNA G-四鏈體復(fù)合物(圖3-B：Ⅲ)；NZR2單獨存在時有4個特征峰分布，表明其自身則可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)(圖3-B：Ⅳ)；在(NZ484+NZR2)混合體系中，有除NZR2 G-四鏈體特征峰外的新峰出現(xiàn)，說明NZ484和NZR2之間可以形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物(圖3-B：Ⅴ)。綜上所述，賈第蟲端粒序列既可以形成DNA-DNA G-四鏈體復(fù)合物，又可以形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物。

A：K+條件下賈第蟲端粒序列片段的一維氫譜(6.9～8.7 ppm；10.3～12.2 ppm)。B：Na+條件下賈第蟲端粒序列片段的一維氫譜(6.6～8.6 ppm；10.2～12.2 ppm)。298 K

2.3 RNA誘導(dǎo)平行-反平行混雜型G-四鏈體復(fù)合物向全平行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化

CD對核酸的構(gòu)象變化非常敏感，可以通過220～320 nm范圍內(nèi)的特征峰分辨具有平行或反平行構(gòu)象的G-四鏈體結(jié)構(gòu)[24-25]，所以我們用圓二色譜對上文中賈第蟲端粒序列所形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)中核酸糖-磷骨架鏈的相對取向進(jìn)行研究。K+條件下，NZ116和NZR2樣品以及(NZ484+NZ116)與(NZ484+NZR2)兩個混合體系的CD譜圖均呈現(xiàn)260 nm處的強正峰，而相同濃度的NZ484樣品的CD譜圖在260 nm處表現(xiàn)出相對弱的正峰。結(jié)合一維氫譜實驗結(jié)果(圖3-A)，表明NZ484在K+條件下無折疊結(jié)構(gòu)存在，而其它4個樣品中形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)均是采用了全平行的鏈取向(圖4-A)。

Na+條件下，NZ484、NZ116和NZR2樣品以及(NZ484+NZR2)混合體系的CD譜圖均出現(xiàn)260 nm處的正峰。同樣結(jié)合一維氫譜實驗結(jié)果(圖3-B)可知，NZ484和NZ116在Na+條件下均不形成G-四鏈體，NZR2和(NZ484+NZR2)混合體系均形成全平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。但是，(NZ484+NZ116)混合體系的CD譜圖不僅顯示出260 nm處的正峰，在295 nm處還出現(xiàn)了一個正峰，這表明該混合體系在Na+條件下形成了同時具有平行與反平行鏈取向的混雜型DNA-DNA G-四鏈體復(fù)合物。隨后，向(NZ484+NZ116)混合體系中加入NZR2形成(NZ484+NZ116+NZR2)三元混合體系后，295 nm處的正峰消失，表明NZR2可以誘導(dǎo)(NZ484+NZ116)混合體系中已形成的平行-反平行混雜型DNA-DNA G-四鏈體復(fù)合物向全平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化(圖4-B)。已知NZ484和NZR2可以形成具有全平行構(gòu)象的G-四鏈體復(fù)合物，所以我們推測，在三元混合體系中， NZR2可以競爭替換掉NZ116與NZ484結(jié)合形成全平行DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物。

A：K+條件下賈第蟲端粒序列片段的CD結(jié)果(220～320 nm)。B：Na+條件下賈第蟲端粒序列片段的CD結(jié)果(220～320 nm)。 298K。□：NZ484；△：NZ116；■：(NZ484+NZ116)混合體系；○：NZR2；▲：(NZ484+NZR2)混合體系；●：(NZ484+NZ116+NZR2)三元混合體系〔在已完成測試的(NZ484+NZ116)混合體系中加入NZR2混勻后直接測量〕

2.4 RNA短鏈與DNA短鏈競爭形成更穩(wěn)定的DNA-RNA分子間G-四鏈體復(fù)合物

為驗證猜想，我們進(jìn)行了滴定實驗。在K+條件下，向(NZ484+NZ116)混合體系中逐漸滴加NZR2至過量，新形成的NZ484-NZR2 G-四鏈體復(fù)合物特征峰(圖5中以▲標(biāo)注)逐漸升高后保持不變(圖5-A)；而原本存在的NZ484-NZ116 G-四鏈體復(fù)合物特征峰(圖5中以*標(biāo)注)逐漸降低到快要消失(圖5-A)。表明NZR2可以競爭替換NZ116與NZ484結(jié)合，形成新的NZ484-NZR2 G-四鏈體復(fù)合物，且該DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物在此三元混合體系中占多數(shù)(圖5-A)。另一方面，向(NZ484+NZR2)混合體系中逐漸滴加NZ116至過量時，原本存在的NZ484-NZR2 G-四鏈體復(fù)合物特征峰只是稍有下降；而新形成的N Z484-NZ116 G-四鏈體復(fù)合物特征峰直到NZ116開始過量時才少量出現(xiàn)(圖5-B)。表明NZ116滴入(NZ484+NZR2)混合體系后，只能使少量的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物向DNA-DNA G-四鏈體復(fù)合物轉(zhuǎn)化，過量滴加NZ116之后的三元混合體系中仍是DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物占主要成分(圖5-B)。綜上可知，NZR2比NZ116更容易結(jié)合NZ484形成更穩(wěn)定的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物，但兩種G-四鏈體復(fù)合物的數(shù)量比例在一定程度上受到DNA和RNA相對濃度變化的影響。

A：向(NZ484+NZ116)混合體系中滴加NZR2的一維氫譜跟蹤結(jié)果(10.5～12.3 ppm)。B：向(NZ484+NZR2)混合體系中滴加NZ116的一維氫譜跟蹤結(jié)構(gòu)(10.5～12.3 ppm)。310K。(NZ116+NZR2)混合體系譜圖為參照；▲：NZ484-NZR2 G-四鏈體復(fù)合物的代表性譜峰；*：NZ484-NZ116 G-四鏈體復(fù)合物的代表性譜峰

Na+條件下得到的滴定實驗結(jié)果與K+條件下一致(圖6-A、B)，表明NZR2比NZ116更容易結(jié)合NZ484形成更穩(wěn)定的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物，但同樣，兩種G-四鏈體復(fù)合物的數(shù)量比例也在一定程度上受到DNA、RNA相對濃度變化的影響。結(jié)合文CD實驗結(jié)果證明，在三元混合體系中， NZR2可以競爭替換掉NZ116與NZ484結(jié)合，誘導(dǎo)平行-反平行混雜型DNA-DNA G-四鏈體復(fù)合物轉(zhuǎn)化為全平行的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物。

A：向(NZ484+NZ116)混合體系中滴加NZR2的一維氫譜跟蹤結(jié)果(9.8～12.1 ppm)。B：向(NZ484+NZR2)混合體系中滴加NZ116的一維氫譜跟蹤結(jié)果(9.9～12.2 ppm)。298K。(NZ116+NZR2)混合體系譜圖為參照；▲：NZ484-NZR2 G-四鏈體復(fù)合物的代表性譜峰；*：NZ484-NZ116 G-四鏈體復(fù)合物的代表性譜峰

3 討論與結(jié)論

本文通過NMR檢測到了人源端粒序列形成的(1+3)DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物，以及賈第蟲端粒序列形成的(3+1)DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物，表明在高等和低等真核生物的端粒序列中均可形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物，且此類復(fù)合物中DNA與RNA的序列長度可以自由組合，而這種DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物的形成可以阻止端粒酶接近端粒末端而抑制端粒酶對端粒的延伸。值得注意的是，文中人源端粒序列NZ117和NZR61序列形成的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物(圖2)，其一維氫譜譜峰分散程度高且具有一定程度上的耐熱性，可以通過改變溫度使個別重疊的譜峰分散，非常有利于后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析工作。

此外，在CD實驗中，我們發(fā)現(xiàn)平行-反平行混雜型DNA-DNA分子間G-四鏈體復(fù)合物可以被RNA誘導(dǎo)形成全平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，這可能與RNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。由于RNA核糖上的2′-OH可以形成額外的相互作用而對整體結(jié)構(gòu)施加空間限制，使得 RNA G-四鏈體主要表現(xiàn)出全平行型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[13, 26]。因此，在RNA與DNA形成分子間G-四鏈體復(fù)合物時，RNA可能會誘導(dǎo)與之結(jié)合的DNA形成全平行的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物。

最后，通過NMR滴定實驗，確定了在混合體系中，RNA短鏈可以與堿基序列相當(dāng)?shù)腄NA短鏈競爭性地結(jié)合另一DNA長鏈分子，自發(fā)形成更穩(wěn)定的DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物，但其形成的數(shù)量比例在一定程度上受到DNA和RNA相對濃度變化的影響(圖5和圖6)。在生物體內(nèi)，端粒RNA濃度隨轉(zhuǎn)錄和降解過程而頻繁變化，這種變化可能使端粒區(qū)的結(jié)構(gòu)也隨之不斷變換：當(dāng)端粒RNA轉(zhuǎn)錄水平較高時，端粒區(qū)主要形成DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物；而當(dāng)端粒RNA降解時，DNA-RNA G-四鏈體復(fù)合物解體，導(dǎo)致與端粒RNA結(jié)合的端粒DNA鏈再被釋放出來。這種RNA水平的變化過程可以使端粒DNA在多種結(jié)構(gòu)狀態(tài)中不斷變換，有可能作為端粒在細(xì)胞周期不同時期產(chǎn)生狀態(tài)差異的調(diào)控機制。