張婷婷， 龍 慧， 滕 麗,3， 蔡小姚， 劉紅美*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

山西人酷愛陳醋的酸，江浙人善用紅醋的酸，而貴州人青睞發(fā)酵后的植物酸[1]。這種植物酸是貴州獨(dú)特的民間飲食酸湯。貴州酸湯文化形成與當(dāng)?shù)氐匦巍夂蚝徒?jīng)濟(jì)等不利因素的影響有關(guān)，人民的生活用品短缺尤其是食鹽的匱乏，加上氣候潮濕，流行腹瀉、痢疾等疾病[2]，貴州人們以酸代鹽的烹調(diào)方法，創(chuàng)造出了既適應(yīng)當(dāng)?shù)氐膼毫迎h(huán)境又清香適口有保健作用的多品種酸湯[3]。研究表明，酸湯中富含多種有機(jī)酸、礦物質(zhì)和益生菌，有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡、助消化、防止便秘、降低膽固醇以及調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能等作用[4]。

酸湯中的益生菌主要菌群有乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等[5]。酵母菌是指主要以單細(xì)胞形式存在，以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖，有性生殖階段不產(chǎn)生子實(shí)體的真菌。酵母菌是單細(xì)胞真核生物，形態(tài)特征通常有橢圓形、球形、卵圓形、檸檬形或藕節(jié)形等[6]。大部分酵母菌的菌落特征和細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠，易挑起；質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色均一；多為乳白色，少數(shù)為紅色，個(gè)別為黑色。酵母菌能在pH為3.0～7.5環(huán)境內(nèi)生長(zhǎng)，最適pH為4.5～5.0，最適生長(zhǎng)溫度為20～30℃[7]。

酵母菌在大自然分布非常廣泛，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中有較高應(yīng)用價(jià)值[8]；如專用酵母菌種在動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，如作為微生態(tài)制劑、著色劑、單細(xì)胞蛋白質(zhì)、發(fā)酵飼料原料等[9]；另外，有些酵母菌可導(dǎo)致食物和飲料腐爛，還有些酵母菌是人體的條件致病菌，能感染皮膚和黏膜系統(tǒng)，并在人體免疫功能低下或免疫系統(tǒng)受損時(shí)，引起致命的擴(kuò)散性深部感染，給人類健康帶來嚴(yán)重威脅[10]。如屬于念珠菌屬的白色假絲酵母菌是人類最常見的致病菌，感染后可引起皮膚黏膜念珠菌病、內(nèi)臟念珠菌病及念珠菌血癥等[11]。

真菌病毒是一類可以浸染絲狀真菌、酵母和卵菌，并能在其中復(fù)制的病毒。1962年，HOLLINGS等[12]在英國通過電子顯微鏡在蘑菇栽培中發(fā)現(xiàn)了3種與疾病相關(guān)的球形或短桿狀病毒。1967年，ELLIS等[13]通過電子顯微鏡在匐枝青霉(P.stoloniferum)的培養(yǎng)液中也觀察到了病毒粒子。LAMPSON等[14]也發(fā)現(xiàn)繩狀青霉(Renicilliumfuniculosttm)中的 dsRNA病毒可誘導(dǎo)繩索青霉菌誘導(dǎo)干擾素。在已有的研究基礎(chǔ)上，BANKS等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，匐枝青霉病毒(PenicilliumstoloniferumVirus；PsV)和繩狀青霉病毒(PenicilliumfuniculosumVirus；PfV)的基因組均為dsRNA。在已報(bào)道的真菌病毒中，大多數(shù)病毒為RNA病毒，只有少數(shù)是DNA病毒。RNA病毒根據(jù)其基因組類型分為雙鏈RNA病毒(double-stranded RNA dsRNA)和單鏈RNA病毒(ssRNA)。其中，絕大多數(shù)真菌病毒為dsRNA病毒，只有少數(shù)為ssRNA病毒。目前，真菌病毒主要分為14個(gè)科。其中，7個(gè)科為dsRNA病毒，5個(gè)科為ssRNA病毒，其余2個(gè)科為逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒[16-19]。dsRNA病毒主要屬于6個(gè)科，分別是呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)和巨型雙節(jié)段病毒科(Megabirnaviridae)。全病毒科有5個(gè)屬，分別是全病毒屬(Totivirus)、維多利亞屬(Victorivirus)、梨形鞭毛蟲病毒屬(Giardiavirus)、滴蟲病毒屬(Trichomonasvirus)和利什曼原蟲病毒屬(Leishmaniavirus)[20]。

酵母菌中攜帶有一類真菌病毒，屬于全病毒科(Totiviridae)全病毒屬(Totivirus)雙鏈RNA病毒。此類病毒含2條基因組片段，按片段大小分別命名為L(zhǎng)-A病毒片段(large-size)和M衛(wèi)星殺手病毒片段(medium-size)。有研究表明，攜帶這類病毒的酵母菌株，通過分泌殺手毒素(Killer toxins；KTs)，也稱為抗真菌蛋白(antifugal proteins)，消滅酵母菌株[21-22]。這類真菌病毒通過殺滅其他酵母菌株?duì)I造更多有利于自身的生存空間和資源，但同時(shí)也打破了原有的微生物動(dòng)態(tài)平衡。因此，筆者通過篩選貴州發(fā)酵紅、白酸湯中的酵母菌，檢測(cè)其攜帶真菌病毒的攜帶率和多樣性，為下一步研究攜帶真菌病毒的酵母菌如何調(diào)節(jié)貴州發(fā)酵紅、白酸湯中微生物群落的動(dòng)態(tài)平衡提供試驗(yàn)材料，為揭秘發(fā)酵酸湯獨(dú)特口感提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在貴州省都勻、仁懷、遵義和畢節(jié)地區(qū)用高壓滅菌的2 mL離心管，收集酸湯樣品，采集后保存于4℃冰箱，待分離。

1.1.2 試劑 YEPD固體培養(yǎng)基、頭孢(100 mg/mL)、50×TAE、2×GPS、10% SDS、氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)、苯酚、無水乙醇、洗脫緩沖液、1×STE、3 mol/L醋酸鈉(pH=5.2)、異丙醇、75%乙醇、DEPC-H2O、10×STE、1%(w/v)瓊脂糖凝膠等。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平、pH調(diào)節(jié)計(jì)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、移液器、電磁爐、微波爐、冰箱、立式超低溫保存箱、瓊脂糖凝膠電泳儀電源、4℃離心機(jī)、反滲透超純水機(jī)、振蕩器等。

1.2 分離純化酵母菌

用移液槍吸取1 mL酸湯樣品、9 mL無菌水置于10 mL試管中，振蕩混勻，標(biāo)記為10-1稀釋度，用1 mL移液槍吸取1 mL 10-1稀釋度的培養(yǎng)液于9 mL無菌水試管中，標(biāo)記為10-2稀釋度，依次稀釋，共7個(gè)梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，用移液槍吸取100 μL菌液于YEPD固體培養(yǎng)基(含100 mg/mL頭孢)的平板上進(jìn)行涂布，每個(gè)稀釋梯度平行涂布3個(gè)平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取YEPD固體培養(yǎng)基中不同形態(tài)、不同大小的菌落在YEPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)多次劃線純化得到單一菌落。

1.3 PCR反應(yīng)期電泳檢測(cè)

利用1.2方法提取的酵母菌DNA樣品2 μL為擴(kuò)增模板，引物ITS12 μL，引物ITS42 μL，ddH2O 19 μL，混合物25 μL，總體積為50 μL；空白不加樣品，ddH2O改為21 μL，其余相同。擴(kuò)增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。然后將5 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣至1%瓊脂糖凝膠(已加入染色液)的點(diǎn)樣孔中，電壓110 V，電流90 mA，時(shí)間約30 min。用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果，將合格的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送檢。

1.4 DNA和dsRNA的提取及純化

挑取培養(yǎng)的目標(biāo)菌株，將菌絲體在液氮冷凍條件下用碾缽研磨成粉末狀，裝入無菌離心管中。每0.4 g樣品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚(Tris-HCl飽和，pH 8.0)、600 μL氯仿-異戊醇(體積比24∶1)和138 μL 10% SDS，劇烈振蕩，使之充分混勻，12 000 r/min、4℃離心10 min。然后取上清液約600 μL，加入0.04 g CF-11纖維素粉末和114 μL無水乙醇，混勻后4℃冰浴過夜。然后離心機(jī)12 000 r/min離心5 min后棄上清液，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入600 μL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復(fù)洗脫3次后，加入640 μL 1×STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取600 μL上清液至新的無菌離心管中，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，加入1倍體積的異丙醇，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min、4℃離心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振蕩無菌離心管，將沉淀彈起，清洗沉淀，12 000 r/min、4℃離心5 min后棄去上清液，用移液槍吸去管底的多余液體，風(fēng)干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株中的真菌病毒。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察各菌株攜帶真菌病毒的條帶特征。

1.5 菌種的保藏

挑取經(jīng)過ITS鑒定的酵母菌菌株，放在YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，28℃振蕩培養(yǎng)24 h。取0.5 mL培養(yǎng)的酵母菌液與0.5 mL的50 %無菌甘油以1∶1比例混合，標(biāo)記菌種名稱和保存時(shí)間，放于-80℃低溫冰箱保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集的酸湯樣品

2.1.1 收集 試驗(yàn)共收集了51份發(fā)酵酸湯樣品，其中都勻市(DY)采集7管，仁懷市(RH)采集7管，遵義市桐梓縣(TZ)采集9管，畢節(jié)市納雍縣(NY)采集26管(圖1)。由圖1可見，不同的發(fā)酵酸湯樣品顏色深淺不一。另外，不同發(fā)酵酸湯樣品的濃稠度也不同，這可能與發(fā)酵酸湯樣品的發(fā)酵時(shí)間以及含有微生物的多樣性不同有關(guān)。

2.1.2 樣品的pH 由表1可知，從畢節(jié)納雍縣(NY)采集的26管發(fā)酵酸湯pH平均值趨于5.5，從仁懷市(RH)、都勻市(DY)、遵義市桐梓縣(TZ)3地采集的發(fā)酵酸湯pH平均值趨于3.87?；诮湍妇茉趐H為3.0～7.5內(nèi)生長(zhǎng)，最適pH為4.5～5.0，表明貴州發(fā)酵酸湯的酸度適合酵母菌株的生長(zhǎng)繁殖。不同地區(qū)發(fā)酵酸湯pH不同，表明樣品中微生物的多樣性可能存在一定的差異。

表1 酸湯樣品pH

2.2 YEPD培養(yǎng)基上微生物菌落形態(tài)

如圖2所示，不同發(fā)酵酸湯樣品在YEPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出不同菌落形態(tài)的微生物，從菌落顏色看，主要為乳白色、奶白色、灰白色、粉紅色等；從菌落形狀看，主要為橢圓、圓形，部分為放射狀，菌落邊緣多整齊均一，菌落側(cè)面多為凸起、隆起或扁平，其表面多是光滑濕潤(rùn)，少數(shù)是干燥粗糙；菌落質(zhì)地多樣(緊實(shí)、松軟易挑起、粘稠)；打開培養(yǎng)皿常伴有淡淡的發(fā)酵酒香。另外，在一些培養(yǎng)皿中也有絲狀真菌和疑似細(xì)菌的菌落出現(xiàn)。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從YEPD培養(yǎng)基上挑取疑似酵母形態(tài)的菌落，使用ITS1和ITS4引物擴(kuò)增PCR后連接載體測(cè)序，最后篩選出47株酵母菌株(圖3)。其中，Sacchaomycescerevisiae有21株，Zygosaccharomycesbailii有9株，Pichiakudriavzevii有6株，Candidatropicalis有4株，Candidautilis有3株，Kazachstaniahumilis有2株，Galactomycessp和Candidaglabrata各1株。

2.4 DNA和dsRNA真菌病毒的檢測(cè)

由圖4可知，檢測(cè)樣品共47孔，粗提dsRNA攜帶病毒條帶的有37孔，攜帶率約79%；試驗(yàn)菌株中，病毒RNA的攜帶率高，且條帶較多樣化，主要出現(xiàn)在1～5 kbp。

3 結(jié)論與討論

貴州發(fā)酵酸湯清涼解渴且風(fēng)味獨(dú)特，其中的益生菌群及豐富的營養(yǎng)成分可調(diào)整人體腸道微生物生態(tài)平衡，增進(jìn)人體健康及預(yù)防消化道疾病等，另外發(fā)酵酸湯也可作為地方特產(chǎn)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，促進(jìn)貴州經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。雖然酸湯產(chǎn)業(yè)取得了一定的成績(jī)，但快速健康地發(fā)展仍面臨很多問題。酸湯產(chǎn)品在儲(chǔ)藏過程中，常容易發(fā)生腐敗變質(zhì)，取代酸湯的清香變?yōu)榘背?，?yán)重影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)[23]。

酵母菌屬于單細(xì)胞真菌，多存在于含糖量高、酸度大的水生環(huán)境中，如貴州發(fā)酵酸湯是其較好的生存環(huán)境之一。長(zhǎng)久以來，酵母菌因?yàn)樯L(zhǎng)快、代謝旺盛、特殊代謝產(chǎn)物繁多等特點(diǎn)而在食品、酒精、醫(yī)藥、飲料等行業(yè)被廣泛應(yīng)用，對(duì)酵母菌的資源研究和使用大大改善和豐富了人類的生活。此外，真菌病毒廣泛分布于各種真菌和卵菌類群中，其中對(duì)寄主菌具有弱毒能力的真菌病毒具有作為生防資源的利用價(jià)值；有一類真菌病毒可以通過分泌殺手毒素殺滅同種或不同種酵母菌株[24-26]。而貴州發(fā)酵酸湯中的酵母菌為研究真菌病毒提供了切實(shí)可行的研究對(duì)象。

值得注意的是，有的條件致病真菌在自然界或25℃培養(yǎng)時(shí)呈菌絲形態(tài)(即菌落呈毛樣)，而在組織中或在37℃培養(yǎng)時(shí)則呈酵母形態(tài)，這種因環(huán)境溫度不同菌落形態(tài)亦不同的真菌稱為雙相真菌[27-28]。因此，在試驗(yàn)初期篩選酵母菌時(shí)，也要盡可能將非顯著酵母菌形態(tài)特征的菌株進(jìn)行粗提dsRNA。雖增大了篩選工作量，但也增加了篩選到目標(biāo)菌株的可能性。

試驗(yàn)從貴州發(fā)酵酸湯中分離和鑒定出攜帶真菌病毒的酵母菌株，對(duì)攜帶真菌病毒的酵母調(diào)節(jié)貴州酸湯的微生物生態(tài)平衡研究既提供了大量目的菌株，也對(duì)后續(xù)研究真菌病毒的基因組序列及鑒定其病毒分類學(xué)分類地位起到重要作用。