張婷婷， 滕 麗， 蔡小姚， 劉紅美*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

真菌病毒(mycovirus或Fungal viruses)是一類感染絲狀真菌、蘑菇和酵母并在寄主體內(nèi)復(fù)制與增殖的病毒。1953年，Shope最早在繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)中分離得到一種可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物合成干擾素提高動(dòng)物抗病毒能力的物質(zhì)，稱為“Helenine”。1962年，真菌病毒被首次報(bào)道，英國(guó)科學(xué)家HOLLINGS[1]在發(fā)病的雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)子實(shí)體中發(fā)現(xiàn)了球形病毒和短棒狀病毒的病毒粒體，通過分離病毒粒體接種到健康的蘑菇，呈現(xiàn)了病害傳播的過程，這標(biāo)志了真菌病毒學(xué)的開端。病毒基因組的核酸類型和病毒基因的復(fù)制方式是真菌病毒分類的主要依據(jù)，目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)真菌病毒的基因組核酸是雙鏈核糖核酸(double-stranded RNA，dsRNA)。dsRNA病毒主要屬于6個(gè)科，分別是呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)和巨型雙節(jié)段病毒科(Megabirnaviridae)[2]。然而，近年來越來越多的dsRNA被證明尚未分類[3-5]。

水稻稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌(有性態(tài)：Villosiclavavirens；無性態(tài)：Ustilaginoideavirens)侵染造成的一種水稻穗部真菌類病害，病原菌侵染導(dǎo)致水稻小花上形成體積數(shù)倍于稻粒的病原菌菌落，即稻曲球[6-7]。近20年來，由于中國(guó)水稻肥水施用水平的普遍提高和大穗型品種的大面積推廣，稻曲病的發(fā)生呈加重趨勢(shì)，由一個(gè)歷史上零星、偶發(fā)性病害演變成為中國(guó)各水稻產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[8-9]。稻曲病的發(fā)生不但對(duì)水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)造成威脅，同時(shí)由于稻曲病菌能夠產(chǎn)生大量毒素(Ustiloxins)，對(duì)人、動(dòng)物和植物的細(xì)胞分裂具有強(qiáng)烈的抑制作用[10-13]，用稻曲病粒拌飼料喂家兔和當(dāng)?shù)啬鸽u，經(jīng)35～84 d喂養(yǎng)，可引起死亡和內(nèi)臟器官病變，用帶稻曲菌的谷糠喂豬，母豬出現(xiàn)產(chǎn)死胎、干尸胎和畸形胎等癥狀[8]。因此，對(duì)稻米的食用安全和稻田周邊食草動(dòng)物帶來潛在的威脅。

2010年代，ZHANG等[14]首次報(bào)道了水稻稻曲病菌菌株中攜帶真菌病毒，關(guān)于稻曲病菌中攜帶真菌病毒報(bào)道隨之增加[5，15-18]。而筆者從稻曲病菌菌株GZ-2中分離的真菌病毒，病毒命名為UstilaginoideavirensUnclassified virus 2(UvUV2)。對(duì)UvUV2的全基因組序列測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)UvUV2尚未被分類。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 稻曲病菌菌株GZ-2于2015年從貴州省稻曲病菌侵染的水稻稻曲球中分離。

1.1.2 試劑 氨芐青霉素(Ampicillin；Amp)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DNA膠回收試劑盒購自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，2×PCR mix購自北京康潤(rùn)誠業(yè)生物科技有限公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司，DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Klenow酶、pMD18-T載體、T4RNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 制冰機(jī)、電冰箱、電泳儀、培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、凝膠成像儀、恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、超凈實(shí)驗(yàn)工作臺(tái)等。

1.2 稻曲病菌菌株GZ-2的分離

將稻曲球切分成小塊，用5%的次氯酸鈉將新鮮的稻曲球進(jìn)行表面消毒1 min，用無菌蒸餾水浸泡3次，隨后用75%的酒精表面消毒1 min左右，再用無菌蒸餾水浸泡3次，然后置于無菌離心管中震蕩制備成稻曲病菌厚垣孢子的懸浮液，并用無菌蒸餾水將厚垣孢子懸浮液稀釋成10倍梯度的孢子液，用移液槍吸取100 μL不同梯度的孢子液，分別涂布于含有100 μg/mL頭孢霉素的土豆葡萄糖培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察分離結(jié)果，待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落。對(duì)所有成功分離獲得的菌株進(jìn)行編號(hào)，保存于-20℃冰箱中。

1.3 dsRNA的提取及純化

挑取目標(biāo)菌株GZ-2，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d。將菌株GZ-2的菌絲體在液氮冷凍條件下用碾缽研磨成粉末狀，裝入無菌離心管中。每0.4 g樣品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚(Tris-HCl飽和，pH 8.0)、600 μL氯仿-異戊醇(體積比24∶1)和138 μL 10% SDS，劇烈振蕩，使之充分混勻，12 000 r/min、4℃離心10 min。然后取上清液約600 μL，加入0.04 g CF-11纖維素粉末和114 μL無水乙醇，混勻后4℃過夜。然后離心機(jī)12 000 r/min離心5 min后棄上清液，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入600 μL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復(fù)洗脫3次后，加入640 μL 1×STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取600 μL上清液至新的無菌離心管中，然后取上清液600 μL緩慢移入管中，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，加入1倍體積的異丙醇，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min、4℃離心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振蕩無菌離心管，將沉淀彈起，清洗沉淀，12 000 r/min 4℃離心5 min后棄去上清液，用移液槍吸去管底的多余液體，風(fēng)干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株GZ-2中的真菌病毒。用DAaseI(RNase free)和S1核酸酶處理樣品，去除樣品中的DNA和單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)污染。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察UvUV2的條帶特征。

1.4 cDNA合成及分子克隆

將純化的dsRNA樣品作為模板，采用FROUSSARD[19]描述的隨機(jī)引物擴(kuò)增法獲得了UvUV2的隨機(jī)序列。病毒末端克隆的方法參考POTGIETER等[20]采用的方法，首先在dsRNA的兩末端加1段已知序列的接頭片段，然后將加上接頭的dsRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，最后用與該序列互補(bǔ)的一段寡核苷酸作為引物，另一引物根據(jù)已測(cè)定序列設(shè)計(jì)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction；RT-PCR)獲取dsRNA末端的序列。將擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 序列拼接及系統(tǒng)進(jìn)化分析

測(cè)序得到的序列被組裝并上傳GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲取的登錄號(hào)為MH094804。序列拼接、分析和比對(duì)使用DNAMAN 7.0和COBALT web服務(wù)器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink)；序列同源性搜索使用NCBI網(wǎng)站的在線BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用最大相似性法則(maximum-likelihood，ML)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。ML樹的計(jì)算使用MEGA 5.0軟件[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 UvUV2的條帶類型

水稻稻曲病菌株GZ-2中提取的真菌病毒，經(jīng)DNaseI和S1核酸酶處理，在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見到在3 kbp附近有1條單一的明顯的dsRNA條帶(圖 1)，命名為UstilaginoideavirensUnclassified virus 2(UvUV2)。

2.2 UvUV2中間序列的獲取

菌株GZ-2攜帶的dsRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增得到大量隨機(jī)片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈彌散條帶(圖2)。切下750～1 000 bp的隨機(jī)片段進(jìn)行膠回收、連接、克隆，挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠上呈大小不一的單一片段(圖3)。挑取較大的隨機(jī)片段進(jìn)行測(cè)序、拼接。

2.3 UvUV2末端序列的獲取

UvUV2兩末端非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不能通過隨機(jī)片段擴(kuò)增得到，需在獲得UvUV2中間序列的基礎(chǔ)上在2個(gè)末端加上1個(gè)接頭引物后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，另一端再用基于已獲取的UvUV2片段，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增才能得到末端序列。擴(kuò)增得到的末端序列通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，部分結(jié)果如圖4所示。將目的片段切膠回收經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序等步驟獲得序列。

2.4 UvUV2序列

如圖5所示，UvUV2全長(zhǎng)2 887 bp，G+C含量為58.8%。通過隨機(jī)引物擴(kuò)增法得到UvUV2的隨機(jī)片段(圖5中1～16)，經(jīng)過DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行序列拼接，發(fā)現(xiàn)并不能完全拼接出1條完整的全基因序列。隨后，根據(jù)已獲取的基因組序列設(shè)計(jì)特異性的搭橋引物A和B，通過PCR克隆出未獲得的基因組序列，用Potgieter等描述的方法擴(kuò)增5′和3′末端[22]。最后通過DNAMAN 7.0軟件拼接得到1條完整的UvUV2基因組序列。

2.5 UvUV2的全基因組序列

由圖6可見，UvUV2含有2個(gè)開放閱讀框(ORF1和ORF2)。ORF1起始于第10位堿基，終止于第571位的UAG密碼子，全長(zhǎng)561 bp，編碼186個(gè)氨基酸(20.06 kDa)；ORF2起始于第431位的AGU密碼子，終止于第2 825位堿基，全長(zhǎng)2 394 bp，編碼797個(gè)氨基酸(89.42 kDa)。5′和3′末端非翻譯區(qū)分別長(zhǎng)10 bp和62 bp。通過BlastP比對(duì)分析顯示，ORF1編碼未知蛋白；ORF2編碼依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。2個(gè)ORF框重疊340 bp，ORF2可能以融合蛋白的形式與ORF1一起通過+1核糖體移碼機(jī)制表達(dá)。在UvUV2中發(fā)現(xiàn)基因組序列(CCC_UUU_UAG563-571)類似于甲型流感病毒基因組中的滑動(dòng)序列(UCC_UUU_CGU)，通過+1核糖體移碼促進(jìn)融合蛋白的表達(dá)(圖7)。因此，ORF1和ORF2的融合將產(chǎn)生分子量為104.3 kDa的Gag-Pol融合蛋白。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖8可見， 22株dsRNA病毒科成員UvUV2的RdRp區(qū)域構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。UvUV2與Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)、Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1( NoNRV-1)、Leshenaultpartiti-likevirus(LPLV)、Ustilaginoideavirensnonsegmented virus 1(UvNV-1)、 Bryopsis mitochondria-associated dsRNA(BDRM)形成了一個(gè)獨(dú)立的分支，與已分類的氨基酸序列不在一個(gè)分支，說明UvUV2與已分類病毒的同源關(guān)系較遠(yuǎn)。UvUV2在基因組組織和序列上與PINV-1、NoNRV-1、LPLV、UvNV-1和BDRM高度相似，和相似性高的5株病毒在一個(gè)分類群。推斷，UvUV2與5株病毒一樣屬于未分類病毒，是一種新型真菌病毒，與Partitiviridae家族成員的RdRp有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，但與Amalgaviridae科和Totiviridae科的病毒不同。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)稻曲病菌菌株GZ-2中攜帶的真菌病毒 UvUV2的研究，獲取了該病毒的全基因組信息，從該病毒的基因組結(jié)構(gòu)分析得知，UvUV2全長(zhǎng)2 887個(gè)堿基，含有2個(gè)開放閱讀框(ORF1和ORF2)，ORF1長(zhǎng) 561個(gè)堿基，BlastP比對(duì)結(jié)果表明編碼未知蛋白，ORF2長(zhǎng)2 394個(gè)堿基，BlastP比對(duì)結(jié)果表明編碼依賴RNA的 RNA聚合酶(RdRp)。在UvUV2基因組序列(CCC_UUU_UAG563-571)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)類似于甲型流感病毒基因組中的滑動(dòng)序列(UCC_UUU_CGU)的基因序列，通過+1移碼促進(jìn)Gag-Pol融合蛋白基因的表達(dá)。另外，BlastP的同源性搜索表明，UvUV2的ORF1和ORF2與PINV-1、NoNRV-1和UvNV-1共3種未分類病毒編碼的蛋白高度相似。綜上所述，表明UvUV2屬于新型未分類的病毒科。

在很多病毒的基因表達(dá)過程中存在一種叫程序性核糖體移碼(Programmed Ribosomal Frameshifting；PRF)的蛋白質(zhì)翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制，常見的類型包括，+1程序性核糖體移碼機(jī)制(+1PRF)和-1程序性核糖體移碼機(jī)制(-1PRF)。目前研究表明，+1PRF機(jī)制的產(chǎn)生只需要1個(gè)六聚體核糖體移碼序列元件(UUU_CGN， N=A，U，G，C)[23]。

在UvUV2基因組序列(CCC_UUU_UAG563-571)中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)類似于甲型流感病毒基因組中的滑動(dòng)序列(UCC_UUU_CGU)的基因序列，通過+1移碼[24]促進(jìn)PA基因的表達(dá)。此外，在預(yù)測(cè)的滑動(dòng)序列中，ORF1中存在1個(gè)終止密碼子(帶下劃線的CCC_UUU_UAG569-571)，表明其與Closteroviridae[25]家族成員和Euplotes屬纖毛原生動(dòng)物[26]相似，在這些原生動(dòng)物中，移碼發(fā)生在“移位停止”移碼位點(diǎn)[27]。這些位點(diǎn)由終止密碼子組成，前面緊跟著1個(gè)光滑的序列，可以允許+1移碼(纖毛蟲中的AAA和Closteroviridae科某些成員中的UUU)[25-26]。

利用ORF1推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行的BlastP搜索顯示，序列與3種未分類病毒編碼的蛋白高度相似，即Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)同源性為78%[4]、Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(NoNRV-1)同源性為53%[28]和Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(UvNV-1)同源性為40%[5]。根據(jù)BlastP分析，ORF2編碼的依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)與Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)同源性為78%與Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(NoNRV-1)同源性為45%和Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(UvNV-1)同源性為40%。這些數(shù)據(jù)表明，UvUV2很可能代表了一種感染稻曲病菌的新型dsRNA病毒。雖然UvUV2和UvNV1具有不分段的相似之處，并且具有類似于Totivirus的基因組結(jié)構(gòu)，但其在基因組結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度上表現(xiàn)出不同。UvUV2的全序列(2 887 bp)比UvNV1的全序列(3 768 bp)短得多。此外，UvUV2的5′和3′非編碼區(qū)較短，分別為10 bp和62 bp，而UvNV-1的5′和3′非編碼區(qū)分別為741 bp和296 bp。因此，可以推測(cè)UvUV2是一種新型的、未分類的真菌病毒。