潘麗，蘇文，林道彬

珠海市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心1、檢驗(yàn)科/遺傳所2，廣東 珠海 519000

黏多糖貯積癥Ⅲ型(mucopolysaccharidosisⅢ，MPSⅢ)又稱Sanfilippo綜合征，屬于常染色體隱性遺傳病，是由于硫酸乙酰肝素降解過(guò)程中所需的四種不同酶的缺陷所致[1-2]，屬于一組溶酶體貯積癥。據(jù)缺陷酶類型的不同，可以把MPSⅢ分為ⅢA、ⅢB、ⅢC和ⅢD四種亞型。ⅢA型是由于乙酰肝素N-硫酸酯酶(heparan N-sulfatase，SGSH)缺陷，使硫酸乙酰肝素不能降解而在細(xì)胞內(nèi)積聚，從而導(dǎo)致進(jìn)行性多系統(tǒng)損害。4種亞型的患者臨床表現(xiàn)非常相似，主要為進(jìn)行性的智力減退。該病臨床罕見，在國(guó)外新生兒中的發(fā)病率為1/70 000，而國(guó)內(nèi)1998年至今報(bào)道黏多糖貯積癥Ⅲ型產(chǎn)前診斷的文獻(xiàn)僅一篇[3]?；蛟\斷和產(chǎn)前診斷，是目前預(yù)防并阻斷該病遺傳的有效方法。近年來(lái)，全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing，WES)技術(shù)因?yàn)榫哂懈咄?、高?zhǔn)確性，還具有高速度等特點(diǎn)，已經(jīng)被越來(lái)越多的臨床醫(yī)生接受，并且應(yīng)用于臨床診斷[4]。本研究應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)一個(gè)罕見MPSⅢ型家系進(jìn)行突變分析，明確了家系的致病原因，并為該家系進(jìn)行了詳細(xì)的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報(bào)道如下：

1資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，女，38歲，瑤族，因“停經(jīng)16+周，不良生育史，高齡”于2019年7月就診于珠海市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心。既往體健，G4P2A1，2007年足月順產(chǎn)一女，體健。2013年足月順產(chǎn)一男(該患兒為先證者)，現(xiàn)年6歲，出生時(shí)無(wú)特殊，2歲以后出現(xiàn)進(jìn)行性加重的智力低下，聽力下降，語(yǔ)言發(fā)育落后，只能發(fā)單音，頭部狹長(zhǎng)。夫妻雙方臨床表型正常，否認(rèn)近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 孕婦及家屬知情同意，抽取患兒及其父母的外周靜脈血各5 mL，EDTA抗凝，用基因組提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)提取外周血DNA，-20℃保存。胎兒羊水標(biāo)本10 mL，基因組提取試劑盒提取羊水DNA，-20℃保存。

1.2.2 羊膜腔穿刺術(shù) 孕婦及家屬知情同意，孕19周選擇羊膜腔穿刺術(shù)。術(shù)前再次行B超檢查，明確胎兒雙頂徑、羊水池深度等情況。采用日本進(jìn)口22G150 mm PTC穿刺針，B超引導(dǎo)下進(jìn)針，抽取羊水10 mL送細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析、染色體微陣列分析及全外顯子測(cè)序。

1.2.3 染色體核型分析 外周血或羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)收獲、制片、消化、G顯帶染色以及掃描后，行染色體核型分析。

1.2.4 染色體微陣列分析 使用美國(guó)Affymetrix公司的全基因組CytoScan 750K芯片，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作流程，進(jìn)行基因組DNA的消化、連接、PCR擴(kuò)增、純化、芯片雜交、洗滌、掃描，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析過(guò)程參考實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)及在線公共數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.5 全外顯子測(cè)序 送深圳華大臨床檢驗(yàn)中心，進(jìn)行全外顯子測(cè)序。首先利用Covaris LE220超聲波儀(Massachusetts，USA)將基因組DNA打斷并制備文庫(kù)，然后通過(guò)芯片對(duì)目標(biāo)基因外顯子及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，最后使用高通量測(cè)序平臺(tái)BGISEQ-500進(jìn)行變異檢測(cè)，并依據(jù)ACMG指南判斷變異的致病性[5-8]。參考dbscSNV(1.1)數(shù)據(jù)庫(kù)、EPS6500(V2)數(shù)據(jù)庫(kù)、ExAC(r0.3.1)數(shù)據(jù)庫(kù)及千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行信息學(xué)分析，參考基因突變相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)GnomAD(r2.0.1)和Clinvar進(jìn)一步對(duì)可疑致病位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，找出致病位點(diǎn)。

1.2.6 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)全外顯子測(cè)序的結(jié)果，采用Sanger測(cè)序?qū)ο茸C者及其父母進(jìn)行驗(yàn)證，明確致病位點(diǎn)，并對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

1.2.7 遺傳咨詢 由經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的臨床遺傳咨詢醫(yī)師進(jìn)行所有項(xiàng)目的檢測(cè)前、檢測(cè)后以及患兒預(yù)后、治療的詳細(xì)遺傳咨詢及臨床評(píng)估。

2結(jié)果

2.1 患兒及其父母全外顯子測(cè)序結(jié)果 患兒全外顯子測(cè)序，目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度為144.03倍，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度達(dá)99.89%，其中測(cè)序深度達(dá)到20倍以上的區(qū)域占全部芯片目標(biāo)捕獲區(qū)域的98.00%，芯片對(duì)目標(biāo)區(qū)域覆蓋良好。通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，篩選出了多個(gè)突變位點(diǎn)，詳見表l。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了SGSH基因的NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)突變已有致病性相關(guān)報(bào)道[9-10]，且ESP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人數(shù)據(jù)庫(kù)、EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)該突變。綜合分析患兒臨床表型、突變位點(diǎn)，以及其父母雙方的全外顯子測(cè)序結(jié)果，最終確定該突變?yōu)樵摷蚁档闹虏⊥蛔儭?/p>

表1 患兒全外顯子測(cè)序檢測(cè)相關(guān)突變結(jié)果及突變來(lái)源

2.2 患兒及胎兒Sanger測(cè)序結(jié)果 患兒檢出SGSH基因的NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)純合突變，其父母均為該突變的雜合攜帶者。明確該家系致病位點(diǎn)后，抽取羊水對(duì)胎兒進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果提示胎兒為該突變的雜合攜帶者。先證者及胎兒的測(cè)序結(jié)果對(duì)比見圖1。

圖1 SGSH基因Sanger測(cè)序結(jié)果

2.3 胎兒染色體核型分析及染色體微陣列分析結(jié)果 因孕婦38歲，為高齡孕婦，故詳細(xì)遺傳咨詢后，在知情同意的前提下，除進(jìn)行胎兒SGSH基因檢測(cè)外，同時(shí)對(duì)胎兒進(jìn)行了染色體核型分析及染色體微陣列分析。胎兒染色體核型分析結(jié)果為46,XN，染色體微陣列分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)已知具有明確臨床致病意義的拷貝數(shù)變異。

3 討論

3.1 全外顯子測(cè)序明確家系致病原因 2011年，WORTHEY等[11]第一次將全外顯子測(cè)序成功應(yīng)用于一名嬰兒，對(duì)其進(jìn)行了罕見炎性腸病突變位點(diǎn)的臨床診斷，相關(guān)檢測(cè)結(jié)論對(duì)該名嬰兒的后期治療產(chǎn)生了非常積極的影響。目前全外顯子測(cè)序在二代測(cè)序技術(shù)中擁有非常大的優(yōu)勢(shì)：(1)與全基因組測(cè)序相比，全外顯子測(cè)序在基因組中所占比例約為2%[12]，所占比例很小，故具有更好的目標(biāo)區(qū)域覆蓋率；(2)因其所需分析的數(shù)據(jù)較少，故數(shù)據(jù)分析更簡(jiǎn)便，也具有更低的價(jià)格；(3)全外顯子測(cè)序技術(shù)還具有高通量、高準(zhǔn)確性以及高速度等特點(diǎn)。正因?yàn)橛羞@些優(yōu)勢(shì)，全外顯子測(cè)序技術(shù)已被越來(lái)越多的臨床醫(yī)生接受，并應(yīng)用于臨床診斷[4]。尤其在2016年，一項(xiàng)涉及54個(gè)國(guó)家1 000個(gè)家庭的研究表明，對(duì)非特異性或異構(gòu)表型的疾病而言，全外顯子測(cè)序是一種有效的診斷工具[13]。綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，多數(shù)研究人員認(rèn)為，全外顯子測(cè)序?qū)ξ创_診疾病的診斷率比經(jīng)典遺傳診斷方法更高。在國(guó)外，甚至已經(jīng)有研究人員呼吁將全外顯子測(cè)序作為未確診疾病的一線診斷工具，以便能給患者帶來(lái)更好的醫(yī)療護(hù)理，但目前還沒有形成相關(guān)的臨床共識(shí)，也沒有相關(guān)的臨床指南出臺(tái)。本研究中，患兒表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的智力低下，聽力下降，語(yǔ)言發(fā)育落后，只能發(fā)單音，頭部狹長(zhǎng)，這些臨床表型均為非特異性，且該患兒也未進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，診斷不明。此外，患兒已有一個(gè)表型正常的同胞姐姐，家族中沒有與患兒相似的病例。在沒有特異性的臨床表型，也沒有家族史的情況下，臨床很難對(duì)其明確診斷?；純耗赣H已經(jīng)孕16+周，要對(duì)胎兒進(jìn)行診斷，迫切需要考慮到時(shí)間效益和經(jīng)濟(jì)效益，需要尋求一次性、全面性的遺傳學(xué)檢測(cè)方法。結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，臨床認(rèn)為該患兒符合全外顯子測(cè)序的應(yīng)用指征[13-14]。在經(jīng)過(guò)詳細(xì)遺傳咨詢、患兒父母知情同意的前提下，應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)該家系進(jìn)行突變分析。筆者發(fā)現(xiàn)并篩選出了多個(gè)變異位點(diǎn)，通過(guò)查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)，綜合患兒臨床表型及其父母全外顯子測(cè)序結(jié)果分析，明確了患兒致病原因?yàn)镸PSⅢA相關(guān)SGSH基因NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)純合突變導(dǎo)致SGSH缺陷而致病，同時(shí)明確患兒父母為該位點(diǎn)雜合突變攜帶者。此外，用Sanger測(cè)序?qū)θ怙@子測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。最終對(duì)患兒母親行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水，對(duì)胎兒進(jìn)行MPSⅢA相關(guān)的SGSH基因同一位點(diǎn)的突變檢測(cè)，明確胎兒為該位點(diǎn)的雜合突變攜帶，有效避免了該家系再次出生MPSⅢA患兒?；純耗赣H年齡為38歲，屬于高齡孕婦，為避免染色體病患兒出生，在進(jìn)行胎兒MPSⅢA相關(guān)的SGSH基因突變檢測(cè)的同時(shí)，也同時(shí)進(jìn)行了染色體核型分析及染色體微陣列分析。

3.2 MPSⅢA的預(yù)后及治療 2018年黏多糖貯積癥被列入我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)、科技部等五部門聯(lián)合發(fā)布的《第一批罕見病》中，該病分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ型等7種，國(guó)內(nèi)報(bào)道較多的是Ⅰ型和Ⅱ型[15-16]。MPSⅢ型在國(guó)內(nèi)尤為罕見,發(fā)病率尚無(wú)報(bào)道。MPSⅢA型屬于Ⅲ型中最嚴(yán)重的一種類型，是由于SGSH缺陷，使硫酸乙酰肝素不能降解而在細(xì)胞內(nèi)積聚，從而導(dǎo)致進(jìn)行性多系統(tǒng)損害，特點(diǎn)為發(fā)病早、生存期短、病情惡化快。臨床主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重退化，但只有輕微的軀體障礙，通常在2～6歲之間開始表現(xiàn)出臨床癥狀，大多數(shù)患者在6～10歲時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)退化。本研究明確了患兒的致病突變位點(diǎn)，回顧分析其臨床表型時(shí)，發(fā)現(xiàn)與MPSⅢA的臨床表型是相符的。基因水平病因的明確為正確評(píng)估患兒將來(lái)的臨床預(yù)后起到了重要作用。

對(duì)于MPS患兒的治療，目前缺乏徹底根治的方法，僅僅是對(duì)癥治療。最有希望的治療方法是特異性的酶替代治療及基因治療，兩者可改善患兒的臨床表現(xiàn)以及生存情況，且目前已有酶替代治療進(jìn)入臨床階段[17]。但MPSⅢ型是一個(gè)困難的挑戰(zhàn)，因?yàn)榕c其他型別的MPS不同，MPSⅢ型患者主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的神經(jīng)退行性改變，故該型的治療中酶作用的主要目標(biāo)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因?yàn)檠X屏障存在，即使血液中的酶濃度很高，也不能有效的穿過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起作用。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有批準(zhǔn)的MPSⅢ酶替代治療方法，但國(guó)外已有研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了針對(duì)MPSⅢ的腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的基因治療策略[17]，相信在不久的將來(lái)MPSⅢ患兒也能接受有效的基因治療。

綜上所述，SGSH基因c.703G＞A(p.Asp235Asn)是該黏多糖貯積癥Ⅲ型家系的致病原因，可以根據(jù)該致病突變對(duì)家系中的攜帶者進(jìn)行產(chǎn)前診斷，避免再次出生黏多糖貯積癥Ⅲ型患兒。且根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，能對(duì)家系中已有的MPSⅢA患兒進(jìn)行準(zhǔn)確的臨床預(yù)后及相應(yīng)治療的評(píng)估。