任麗君，吳碧華 ，劉俊，張梅，楊興

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年科，四川 南充 637000；2.廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，四川 廣安 638000

1986年，MURRY等[1]首次提出了缺血耐受現(xiàn)象。1990年，KITAGAWA等[2]發(fā)現(xiàn)，全腦1次短暫性缺血可以對(duì)再次致死性缺血損傷有明顯的保護(hù)作用，證實(shí)了腦缺血耐受現(xiàn)象的存在，第一次短暫腦缺血稱(chēng)為缺血預(yù)處理。隨后越來(lái)越多的研究報(bào)道了缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用，如缺氧[3]、低溫[4]、皮層擴(kuò)散性抑制[5]、遠(yuǎn)隔器官缺血[6]、電針[7]、化學(xué)物質(zhì)[8]均可以誘導(dǎo)腦缺血耐受。然而，這些預(yù)處理方法大多會(huì)對(duì)機(jī)體造成潛在的傷害，因此尋找較為安全的預(yù)處理方法尤為重要。

重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是將一定頻率和強(qiáng)度的磁脈沖以成串刺激的方式以一定時(shí)間間隔連續(xù)發(fā)放，由于其安全無(wú)創(chuàng)常用于治療方面的研究。本研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)全腦缺血大鼠進(jìn)行連續(xù)兩周的高頻rTMS刺激，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到改善[9]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討高頻rTMS刺激預(yù)處理對(duì)全腦缺血大鼠再灌注腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型制備 成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量(230±20)g，均購(gòu)自川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：scxk(川2008-18)]，隨機(jī)區(qū)組法分為對(duì)照組、模型組、rTMS預(yù)刺激3次、rTMS預(yù)刺激7次，每組10只。模型組和rTMS預(yù)刺激組采用改良四血管阻斷法(4-VO法)[10]造模，凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，24 h后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15 min，松開(kāi)動(dòng)脈夾后恢復(fù)血流灌注，制備全腦缺血再灌注損傷模型。

1.2 高頻rTMS刺激 磁刺激頻率10 Hz，100個(gè)脈沖/串，12串/d，每串間隔30 s，刺激強(qiáng)度為0.5 T。腦缺血再灌注模型與磁刺激間隔為48 h，rTMS預(yù)刺激組分別于造模前給予磁刺激3次和7次。

1.3 改良神經(jīng)功能評(píng)分 再灌注24 h后，采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)[11]評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷程度。mNSS評(píng)分包括行動(dòng)能力測(cè)試、感覺(jué)測(cè)試、反射測(cè)試3大項(xiàng)，14小項(xiàng)，總分14分。評(píng)分越低，損傷程度越輕。

1.4 血腦屏障通透性 對(duì)大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，然后用10%水合氯醛(3.8 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后，尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)4 mL/kg。2 h后心臟灌流，冰盒上迅速分離腦組織，將腦組織9 mL/g浸入甲酰胺溶液中，45℃避光孵育72 h，15 000 r/min離心20 min，取上清。酶標(biāo)儀測(cè)量光密度(optical density，OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)讀出伊文思藍(lán)濃度。

1.5 蛋白免疫印跡法 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，分離海馬組織，將組織研磨后加入蛋白裂解液，取上清液，用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上分別滴加1∶5 000兔抗鼠BDNF、1∶1 000兔抗鼠pTrkB，4℃孵育過(guò)夜，滴加山羊抗兔IgG抗體37℃孵育2 h，在PVDF膜上滴加適量ECL發(fā)光液，放入曝光儀曝光顯影，用Quantity One軟件分析檢測(cè)目的蛋白條帶的灰度值，用目的條帶灰度值除以相應(yīng)β-肌動(dòng)蛋白條帶灰度值得到目的蛋白條帶灰度值比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 rTMS預(yù)處理組mNSS評(píng)分較模型組降低，rTMS預(yù)處理7次mNSS評(píng)分較rTMS預(yù)處理3次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s)

表1 各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s)

注：rTMS刺激組與模型組比較，aq=3.543，P=0.028，bq=3.729，P=0.017；rTMS預(yù)刺激7次組與rTMS預(yù)刺激3次組比較，cP=4.354，P=0.015。

對(duì)照組模型組rTMS預(yù)刺激3次組rTMS預(yù)刺激7次組F值P值10 10 10 10 0 9.87±1.23 7.42±1.76a 5.38±1.91bc 3.873 0.021

2.2 各組大鼠的伊文思藍(lán)含量比較 模型組伊文思藍(lán)含量較對(duì)照組升高，rTMS刺激組伊文思藍(lán)含量較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠伊文思藍(lán)含量比較(±s)

表2 各組大鼠伊文思藍(lán)含量比較(±s)

555 9.383±1.093 29.829±8.633a 17.538±1.984b 5.993 0.018

2.3 各組大鼠BDNF和pTrkB免疫印跡表達(dá)水平比較 模型組BDNF和pTrkB蛋白表達(dá)較對(duì)照組減少，rTMS刺激組BDNF和pTrkB蛋白表達(dá)較模型組增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；rTMS預(yù)刺激7次組BDNF和pTrkB蛋白表達(dá)較rTMS預(yù)刺激3次組增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3和圖1。

圖1 各組大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、磷酸化酪氨酸激酶受體B免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果

表3 各組大鼠BDNF和pTrkB免疫印跡表達(dá)水平比較(±s)

表3 各組大鼠BDNF和pTrkB免疫印跡表達(dá)水平比較(±s)

注：對(duì)照組與模型組比較，aq=4.032，P=0.012，bq=3.583，P=0.028；模型組與 rTMS 預(yù)刺激 3次組比較，cq=3.153，P=0.047，dq=3.492，P=0.035；模型組與rTMS預(yù)刺激7次組比較，eq=4.089，P=0.014，fq=3.967，P=0.018；rTMS預(yù)刺激3次組與rTMS刺激預(yù)7次組比較，gq=4.127，P=0.027，hq=3.895，P=0.041。

組別對(duì)照組模型組rTMS預(yù)刺激3次組rTMS預(yù)刺激7次組F值P值pTrkB 28.834±2.197 4.211±0.078b 8.830±1.142d 16.876±1.873gh 4.289 0.026只數(shù)5555 BDNF 31.971±2.381 12.093±1.289a 16.683±1.492c 23.247±1.782ef 5.038 0.018

3 討論

重復(fù)經(jīng)顱磁刺激能對(duì)刺激局部和功能相關(guān)的遠(yuǎn)隔部位產(chǎn)生影響，由于其安全無(wú)創(chuàng)常用于臨床方面的研究[12]。研究報(bào)道，rTMS對(duì)認(rèn)知功能障礙[13]、重癥抑郁[14]等神經(jīng)精神疾病有肯定療效，rTMS可促進(jìn)缺血性腦卒中運(yùn)動(dòng)感覺(jué)障礙[15]、構(gòu)音障礙[16]、單側(cè)空間忽略[17]等功能的恢復(fù)。

近年來(lái)研究報(bào)道，rTMS預(yù)處理能誘導(dǎo)腦缺血耐受，LJUBISAVLJEVIC MILOS等[18]的研究表明，rTMS預(yù)處理可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)合成具有神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白，從而促進(jìn)大鼠缺血再灌注神經(jīng)功能損傷的恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，高頻rTMS預(yù)處理可以降低腦缺血大鼠mNSS評(píng)分，改善缺血再灌注神經(jīng)功能損傷，rTMS預(yù)刺激7次組效果更顯著，表明高頻rTMS預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用可能有時(shí)間累積效應(yīng)。

伊文思藍(lán)常用于血腦屏障功能的檢測(cè)，當(dāng)血腦屏障受損時(shí)，伊文思藍(lán)可以迅速與白蛋白結(jié)合并隨之滲漏至腦組織中。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理[19]及藥物[20-21]能改善血腦屏障的通透性。本實(shí)驗(yàn)中，rTMS刺激組伊文思藍(lán)含量較模型組降低，推測(cè)高頻rTMS預(yù)處理能改善腦缺血大鼠血腦屏障的通透性。血腦屏障破壞以及腦水腫，在急慢性腦缺血再灌注神經(jīng)功能損傷中扮重要角色[22]。高頻rTMS預(yù)處理改善血腦屏障通透性，可能是其改善缺血再灌注神經(jīng)功能損傷的機(jī)制之一。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，如促進(jìn)神經(jīng)元的存活，抑制神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)突觸的生長(zhǎng)和軸突再生等[23]。BDNF與特異性受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)結(jié)合，生成具有生物活性的磷酸化酪氨酸激酶受體B(pTrkB)，pTrkB可募集下游效應(yīng)因子，誘導(dǎo)引起生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)活化[24]。ZHAO等[25]的研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的miR-206通過(guò)激活BDNF/TrkB/CREB信號(hào)通路，對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血繼發(fā)的早期腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。MITROSHINA等[26]發(fā)現(xiàn)，BDNF具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減少原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元缺血性損傷引起的細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)Western blotting結(jié)果表明，高頻rTMS預(yù)處理能上調(diào)缺血再灌注大鼠腦組織BDNF和pTrkB蛋白表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，改善腦缺血再灌注神經(jīng)功能損傷。

綜上所述，高頻rTMS預(yù)處理可以改善全腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能與其改善血腦屏障的通透性、誘導(dǎo)具有神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白表達(dá)增加相關(guān)。