尹端端 王真真 周文文 王小玉 趙子舒 楊雁鴻

【摘要】目的：探討1，25二羥基維生素D3（1，25（OH）2D3）聯合順鉑（DDP）在體外對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響及可能存在的機制。方法：體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細胞，MTT法檢測1，25（OH）2D3和DDP對Hela細胞增殖的影響。流式細胞術分析細胞周期。Western blot檢測1，25（OH）2D3和DDP對Hela細胞內P27蛋白表達水平的影響。結果：所選濃度范圍內（10-8～10-6mol/L）的1，25（OH）2D3對Hela細胞的增殖抑制差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但與作用時間密切相關（P<0.05），DDP濃度在5-20μg/ml范圍內對Hela細胞增殖有明顯的抑制作用，并呈濃度及時間依賴性（P<0.01）。流式細胞儀檢測到1，25（OH）2D3處理12h后聯合DDP組G0/G1期（DNA合成期）細胞比例明顯增多（P<0.01）。Western blot觀察到1，25（OH）2D3處理12h后聯合DDP組細胞內P27蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。結論：1，25（OH）2D3可能通過上調Hela細胞內P27蛋白表達水平，與順鉑協(xié)同促進細胞凋亡、誘導細胞周期阻滯，進而提高順鉑抗腫瘤作用。

【關鍵詞】1，25二羥基維生素D3;宮頸癌Hela細胞;細胞凋亡

【中圖分類號】

R851.7【文獻標識碼】A

【文章編號】2095-6851（2020）08-128-01

維生素D是機體正常運轉不可或缺的重要物質，是脂溶性維生素的一員，屬固醇類衍生物。維生素D的重要生物學作用除了調節(jié)體內鈣磷代謝、保持骨骼強壯外，還能夠直接和間接的參與到機體的免疫調節(jié)。自從20世紀80年代人們發(fā)現，1，25（OH）2D3在人白血病細胞中的抗增殖效應以來，就逐漸確定了它對腫瘤治療的潛力。本實驗將1，25（OH）2D3聯合DDP作用于宮頸癌Hela細胞，詳見下文報道。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞株?宮頸癌Hela細胞株由秦皇島市第一醫(yī)院中心實驗室贈送。

1.1.2?藥物?順鉑凍干粉劑 （DDP） （山東齊魯制藥廠生產） ，1，25二羥維生素D3 （1，25（OH）2D3） （Sigma公司產品）。

1.1.3?主要試劑?四甲基氮唑藍（MTT）（Sigma公司產品）、胰蛋白酶（北京博奧森產品），P27一抗（沈陽萬類生物），二抗（HRP標記羊抗兔）（沈陽萬類生物），DNA小分子量marker（MBI產品），二甲基亞砜（DMSO） （Amresco產品），DMEM高糖培養(yǎng)基（Corning產品），胎牛血清（ 四季青產品），Annexin V/PI試劑盒（聯科生物公司）。

1.1.4?主要儀器?CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），酶標儀（上海科華公司），流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司生產），圖像掃描系統(tǒng)（6661-9μm，明基電通信息技術有限公司），凝膠自動成像儀（Image Master VDS型，Pharmacia公司，瑞典），半干轉膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2?方法

1.2.1?細胞培養(yǎng)?宮頸癌Hela細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，在5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2-3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代一次。

1.2.2?噻唑藍比色法（MTT）計算細胞抑制率?取對數生長期Hela細胞以2×105個/孔接種于96孔板。對照組（等容積培養(yǎng)基）、1，25（OH）2D3設5個濃度組：分別為10-8mol/L、5×10-8mol/L、10-7mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L，DDP設4個濃度組，分別為5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml，1，25（OH）2D3（終濃度為10-6mol/L）聯合DDP（終濃度為10μg/ml）組及1，25（OH）2D3（終濃度為10-6mol/L）預處理+DDP（終濃度為10μg/ml）組，分別作用于Hela細胞24、48、72h后，各孔加入5mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，后各孔加入標準濃度的二甲基亞砜（DMSO）200μl，震蕩混勻15min，490nm波長酶標儀檢測吸光值（OD）。計算24、48、72h各藥物不同處理條件下對Hela細胞的抑制率。公式： 抑制率=（對照組平均吸光值-實驗組平均吸光值）/對照組平均吸光值×100%。

1.2.3?流式細胞術檢測細胞周期?取對數生長期的Hela細胞，以1×106個/孔接種于6孔板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。E組空白對照組（等容積DMEM高糖培養(yǎng)基） 、A組1，25（OH）2D3組（終濃度為10-6mol/L）、B組DDP組（終濃度為10μg/ml）、C組1，25（OH）2D3聯合DDP組及D組1，25（OH）2D3預處理+DDP組。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48h。后制備單細胞懸液、固定、染色后流式細胞儀測定，計算機可自動分析出細胞周期情況。

1.2.4?Western blot技術檢測細胞內P27蛋白的表達水平?將Hela細胞以5×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后分組?？瞻讓φ战M（等容積DMEM高糖培養(yǎng)基）、A組1，25（OH）2D3組（終濃度為10-6mol/L）、B組DDP組（終濃度為10μg/ml）、C組1，25（OH）2D3聯合DDP組及D組1，25（OH）2D3預處理+DDP組。培養(yǎng)48h后每孔加入250μl細胞裂解液（RIPA：PMSF=100：1） 后按以下步驟操作： 提取蛋白、蛋白定量、煮蛋白、配膠、灌膠、電泳、轉膜、封閉、加一抗（P27抗體）、加二抗（HRP標記羊抗兔）、顯影。且相應蛋白表達值為條帶的灰度值除以β-actin內參值校正。

1.3?統(tǒng)計學處理?實驗所得數據資料以均數±標準差（x±s）表示，采取SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對所測得數據進行分析，多因素方差分析用于不同組間的比較，LSD法用于組內兩兩的比較。P<0.05判定是否有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?Hela細胞增殖的抑制作用

1，25（OH）2D3能抑制Hela細胞增殖，并呈時間依賴性。隨著作用時間的延長，其對Hela細胞的抑制率逐漸增高。

DDP能抑制Hela細胞增殖，并呈時間及濃度依賴性。隨著劑量增加及作用時間的延長，其對Hela細胞的抑制率逐漸增高。

聯合1，25（OH）2D3可明顯提高DDP對Hela細胞增殖的抑制作用。

2.2?聯合應用對Hela細胞的影響

E組體現的為未加藥物處理的宮頸癌Hela細胞，B、C、D各組細胞周期中G0/G1期比例均較E組增加（P<0.01）;C、D各組中G0/G1期比例均較B組增加（P<0.01），D組中G0/G1期比例較C組增加（P<0.01）

2.3?聯合應用對Hela細胞內P27蛋白的影響

結果顯示：A～D各組與E組相比，各組細胞內P27蛋白表達明顯增加（P<0.01），C、D組P27蛋白表達較B組有統(tǒng)計學差異（P<0.01），D組相較于C組也有統(tǒng)計學差異（P<0.05）

3?討論

1，25（OH）2D3就是近年來的研究熱點之一。目前了解到的1，25（OH）2D3抗腫瘤作用機理包括引起G0/G1期細胞堆積、上調胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）的表達、抑制腫瘤細胞周圍血管的生成等，進而達到減少癌細胞增殖分化、轉移及浸潤。有研究顯示1，25（OH）2D3可作為潛在輔助治療手段。

本研究提示無論是單藥1，25（OH）2D3、DDP還是兩藥聯合應用，都能使宮頸癌HeLa細胞增殖分化被抑制。MTT實驗發(fā)現，1，25（OH）2D3預處理12h后序貫順鉑組比1，25（OH）2D3聯合順鉑同時處理組的細胞增殖抑制作用更顯著，由此可見，1，25（OH）2D3能提高DDP對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制效果。本實驗流式細胞技術檢測顯示，單藥順鉑能使Hela細胞周期于G0/G1期堆積;單藥1，25（OH）2D3作用一定時間后亦可使Hela細胞周期積滯在G0/G1期，進而抑制細胞的增殖分化，其中，1，25（OH）2D3預處理12h后加順鉑組Hela細胞周期中G0-G1期細胞比例增高最顯著，可見，1，25（OH）2D3可以提高DDP對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制效果。本實驗中Western Blot的研究結果顯示：與空白對照組比對，各組Hela細胞內P27蛋白表達均有不同程度的增加。其中1，25（OH）2D3預處理12h后序貫DDP組Hela細胞內P27蛋白表達增多最明顯。

以上結果顯示，1，25（OH）2D3有提高DDP對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制效果的作用，其抗腫瘤機制尚需進一步研究。

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