趙海燕,許 鈺,班穎芳,蔡吉祥*

(1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546119;2.廣西科技師范學(xué)院 瑤醫(yī)瑤藥重點實驗室，廣西 來賓 546119)

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)或溫郁金的干燥根莖。其具有行氣破血、消積止痛等功效[1]。廣西莪術(shù)也稱桂莪術(shù)，系廣西莪術(shù) (Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang )的干燥根莖，為廣西的道地藥材[2]?，F(xiàn)代研究表明莪術(shù)揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗菌、護肝等多種藥理活性作用[3]。目前莪術(shù)揮發(fā)油常用的提取方法有水蒸氣蒸餾法[4-5]、超臨界流體萃取法[6]、索氏提取法[7]等。微波輔助提取技術(shù)因有提取時間短、能耗低、溶劑用量少、提取率高、成本低等特點近年來在植物揮發(fā)油提取方面應(yīng)用廣泛[8-9]。本實驗以廣西莪術(shù)為原料，利用微波輔助提取法，通過單因素和正交實驗優(yōu)化微波輔助提取揮發(fā)油工藝，并分析其抗氧化活性，為優(yōu)化廣西莪術(shù)莪術(shù)油提取工藝提供參考，以期為廣西莪術(shù)油進一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

廣西莪術(shù)購買于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司。其經(jīng)廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室張鵬博士鑒定為廣西莪術(shù)。DPPH·(上海思誠化工科技有限公司)，三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、七水合硫酸亞鐵、水楊酸(武漢長城化成科技發(fā)展有限公司)，乙醇、雙氧水、抗壞血酸(四川西隴科學(xué)有限公司)，等試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

FW-135 型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；RS-232型精密電子太平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；GZX-GF101-3 BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(III)型循環(huán)水多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)；XH-MC-1型實驗室微波催化合成/反應(yīng)儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；HH-S4 型恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；UV-9600 型 紫外/可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器公司)。

2 實驗方法

2.1 微波輔助提取工藝優(yōu)化方法

2.1.1 微波提取揮發(fā)油方法

準(zhǔn)確稱取干燥廣西莪術(shù)粉末(粉碎后60目過篩)20.0 g，將一定量的無水乙醇倒入三口燒瓶內(nèi)搖勻，置于實驗室微波催化合成儀內(nèi)，以一定的功率提取一定時間后，抽濾數(shù)次至濾紙無殘渣。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮干溶液，于恒溫干燥箱中干燥稱重。按照下式計算莪術(shù)油提取率：

式中m1為莪術(shù)粉原料質(zhì)量；m2為空圓底燒瓶質(zhì)量；m3為有揮發(fā)油的圓底燒瓶質(zhì)量。

2.1.2 單因素試驗

通過單因素實驗初步分析莪術(shù)粉與無水乙醇液料比、提取時間和微波功率三個單因素對莪術(shù)油提取率的影響。稱取處理后的莪術(shù)粉20.0 g，單因素梯度分別為：無水乙醇與莪術(shù)粉料液比(A)1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 g / mL；提取時間(B)3，4，5，6，7 min；微波功率(C)500，600，700，800，900 W，每進行一組試驗，選定一定因素梯度，再逐一進行其他單因素考察。

2.1.3 正交試驗

三個單因素試驗后每個因素選三個水平進行正交試驗，得到正交優(yōu)化后的微波萃取法提取莪術(shù)油的最佳工藝條件。并確定最佳工藝條件下?lián)]發(fā)油提取率。

2.2 體外抗氧化活性測定方法

2.2.1 還原能力測定

微波輔助提取的莪術(shù)揮發(fā)油還原能力測定采用鐵氰化鉀氧化法[10]。陽性對照品為抗壞血酸(Vc)。取3.0 mL不同濃度的樣品溶液(或?qū)φ掌啡芤?依次加入3.0 mL的磷酸緩沖液(pH值= 6.6)和3.0 mL鐵氰化鉀溶液(1 %)，混勻后50 ℃水浴保溫20 min。再加入3.0 mL的三氯乙酸溶液(10%)?；靹蚝笕∩鲜龌旌弦?.0 mL，加入4.0 mL去離子水和0.8 mL的三氯化鐵(0.1%)溶液，靜置10 min。用去離子水為空白調(diào)零，在700 nm下其測吸光值。每個濃度組平行做3次，取其平均值。吸光值越大表示還原能力越強。

2.2.2 清除DPPH·自由基能力測定

取5 mL 6 ×10-55 mol /L的DPPH·乙醇溶液，加入1 mL 不同濃度的樣品溶液，利用漩渦混合器混勻后，室溫靜置30min，在517nm測吸光值，并且測得樣品對DPPH·的清除百分率[11]。DPPH·清除百分率SE(%)計算式為：

(1)

式中：A0是去離子水作為空白對照的吸光度值，AX為含樣品溶液的吸光度值。Ay 為不加顯色劑藥液的本底光密度。

2.2.3 清除羥基自由基能力測定

采用Fenton法[12-13]測定微波輔助提取的揮發(fā)油對·OH的清除能力。具體步驟為分別取9 mmol/L Fe2SO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、不同濃度(200,100,50,25,12.5 μg / mL)的待測樣品溶液(或Vc 溶液)各2.5 mL，加0.25mL 的0.03 % H2O2。同時設(shè)空白對照組，稀釋樣品的溶劑空白對照?；靹蚝箪o置30min，在510nm測其吸光值。樣品組和陽性對照組對·OH的清除率SE(%)按(1)式計算。其中A0為以溶劑代替藥液的試劑空白管的吸光度。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 料液比對揮發(fā)油提取率的影響

選定提取時間5 min、微波功率700 W，分析液料比對莪術(shù)油提取率的影響見圖1。從圖可以看出液料不同比揮發(fā)油提取率不同，料液比小于1∶15 g/mL時，料液比增大莪術(shù)油的提取率增加；液料比1∶15 g/mL時提取率達到最高；液料比再增大，提取率開始下降。最佳料液比為1∶15 g/mL時，莪術(shù)油提取率為4.65 %。

圖1 料液比對揮發(fā)油提取率(%)的影響

3.1.2 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

根據(jù)料液比試驗結(jié)果選定液料比1∶15 g / mL、微波功率700 W，研究提取時間對莪術(shù)油提取率的影響。從圖2可以看出提取時間對莪術(shù)油的提取率有顯著影響。微波提取時間為5 min時，莪術(shù)油提取率最大，提取率為4.71%

圖2 提取時間對揮發(fā)油提取率(%)的影響

3.1.3 微波功率對揮發(fā)油提取率的影響

通過以上單因素實驗選定料液比為1∶15 g / mL、提取時間為5 min，研究微波功率對揮發(fā)油提取率的影響。試驗結(jié)果(圖3)顯示總體上隨著微波功率不斷增大提取率不斷增加，但當(dāng)微波功率超過800 W后，莪術(shù)油提取率略微下降的趨勢，分析原因可能是微波功率過大，導(dǎo)致蒸汽生成速率偏大，不能很好地收集揮發(fā)油導(dǎo)致的。因此本實驗選擇最佳微波功率條件為800 W，此時提取率為5.11 %。

圖3 微波功率對揮發(fā)油提取率(%)的影響

3.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗表，如表1。

表1 正交試驗因素與水平表

按照正交試驗表試驗后得到正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果表

以上正交試驗結(jié)果表明，對揮發(fā)油提取率影響最大的因素為功率，其次是提取時間，料液比對揮發(fā)油提取率的影響相對較小。且從正交表中可觀察到優(yōu)化后最佳工藝條件組合為A3B3C1。由于極差分析得到的較優(yōu)水平A3B3C1與正交表中最佳水平條件組合A2B3C1不一致。所以按照A3B3C1條件組合重新測定揮發(fā)油含量，重復(fù)三次取平均值，得揮發(fā)油提取率為5.18 %。最后確定最佳工藝條件為料液比1∶20 g / mL，提取時間6 min，微波功率900 W。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 還原能力測定結(jié)果

化合物還原能力的強弱，可以反映藥物的潛在抗氧化性能，是體外抗氧化的一個重要指標(biāo)[5-7]。

圖4 揮發(fā)油和Vc的還原能力測定曲線圖

從圖4可知揮發(fā)油的還原能力在一定濃度范圍(12.5～200 μg / mL)內(nèi)隨著樣品濃度增加還原性增強，并且當(dāng)濃度大于100 μg / mL時，揮發(fā)油的還原性明顯好于陽性對照品Vc。

3.3.2 清除自由基能力測定結(jié)果

揮發(fā)油清除DPPH·和·OH能力測定結(jié)果見圖5、圖6。從圖中曲線趨勢可以看出相比于陽性對照Vc，揮發(fā)油對DPPH·和·OH的清除都有較好的效果。當(dāng)樣品濃度達到200 μg / mL時，揮發(fā)油對·OH的清除率可以達到70.5 %，對DPPH·的清除率可達到59.5 %。以上結(jié)果表明微波輔助提取的廣西莪術(shù)揮發(fā)油顯示了較好的清除自由基活性。

圖5 揮發(fā)油對DPPH·清除率(%)的影響

圖6 揮發(fā)油對羥基自由基清除率(%)的影響

4 小結(jié)

本文通過單因素和正交試驗優(yōu)化了微波輔助提取廣西莪術(shù)揮發(fā)油的提取工藝，得到最佳工藝條件為料液比1∶20 g / mL，微波提取時間5 min，微譜功率900 W，最佳工藝條件下?lián)]發(fā)油的提取率為5.18 %。以Vc為陽性對照，分析得到的揮發(fā)油的還原性能力和清除·OH和DPPH·能力，結(jié)果表明微波輔助提取得到的揮發(fā)油在濃度大于100 μg / mL時還原性好于Vc，在12.5～200 μg / mL的濃度范圍內(nèi)隨樣品濃度增加對·OH和DPPH·的清除率逐漸增大，在200 μg / mL時對以上兩種自由基清除率分別可達到70.5 %和59.5 %，顯示了很好的抗氧化效果。