張賽南，施柳佳，廖志銀，王珍，王首鋒*

（1.浙江大學基礎醫(yī)學系，浙江杭州310058； 2.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江杭州310052）

自1928 年弗萊明爵士發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素逐漸成為治療各種細菌感染或致病微生物感染類疾病的“特效藥”，大大提升了人類的健康生活質(zhì)量[1]。近年來，由于抗生素的濫用加速了細菌的耐藥性，由此衍生出DNA 污染、超級細菌等一系列問題[2]。溶菌酶(lysozyme，LYZ)最早由法國科學家尼克爾在枯草桿菌中發(fā)現(xiàn)，其可有效溶解細菌細胞壁的1-4 糖苷鍵，從而起到殺滅細菌的作用[3]，是一種非特異性抗菌物質(zhì)。市售溶菌酶類產(chǎn)品主要用于殺菌防腐[4]，且無毒副作用，具有傳統(tǒng)化學防腐劑不可比擬的優(yōu)點，廣泛用于各種食品[5]和飼料[6]中。

目前，市售的工業(yè)用蛋清溶菌酶(egg white lysozyme，EWL)主要通過化學方法從蛋清或蛋殼中提取，如鹽析法、離子交換層析法[7]、超濾法[8]等。近年來，隨著分子生物學和微生物表達技術(shù)的發(fā)展，通過微生物發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)重組溶菌酶，可以極大地降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)具有真核生物特有的生理體系，可對表達蛋白的加工、外分泌、翻譯后修飾以及糖基化等進行調(diào)控，廣泛應用于外源蛋白的表達[9]。多種類型的外源蛋白，如植物蛋白、動物蛋白在畢赤酵母中獲得了成功表達，大大提高了生物蛋白的利用度。同時對畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)化方法的相關(guān)報道也有不少[10-11]。

本文選用巴斯德畢赤酵母作為表達菌株，并通過蛋清溶菌酶密碼子優(yōu)化這一途徑來獲得高表達蛋清溶菌酶的重組酵母菌，對蛋清溶菌酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)以及應用推廣具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和載體

藤黃微球菌（ATCC4698）購于美國Sigmam 公司，真核表達載體pPIC9K、畢赤酵母菌株GS115、大腸桿菌Top10、BL21 均為實驗室保存。

1.1.2 試劑與工具酶

In-fusion clone 試劑盒（Clontech 公司生產(chǎn)）、高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase)、限制性內(nèi)切酶NotI、EcoRI、SnaBI、SalI 均購于寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購于Axygen 公司；Bradford 蛋白定量試劑盒購于BIOMIGA 公司。Ampicillin、Kanamycin 和 G418 硫酸鹽均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋清溶菌酶標準品和葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50 購于美國Sigmam 公司；強酸性陽離子交換柱SPSepharose FF 購 于 Amersham公司。HD-3000 型電腦核酸蛋白檢測儀購于上海嘉鵬科技有限公司。

1.1.3 菌株培養(yǎng)基

大腸桿菌-LB 培養(yǎng)基，酵母-YPD 培養(yǎng)基，發(fā)酵表達-BMMY、BMGY 培養(yǎng)基，具體的配制以及培養(yǎng)方法參見畢赤酵母多拷貝表達載體試劑盒說明書。

1.1.4 引 物

特異性引物：

通用引物：

1.2 方 法

1.2.1 蛋清溶菌酶基因的密碼子優(yōu)化及重組表達載體的構(gòu)建

從美國國家生物信息中心（NCBI）下載蛋清溶菌酶基因(Gene ID: 396218)的開放閱讀框區(qū)段，在http://www.jcat.de/網(wǎng)站上選取酵母屬作為表達菌株，替換該基因片段的個別密碼子[12]，目的基因序列的合成交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。通過設計與表達載體pPIC9K 具有同源區(qū)段的特異性引物，以coEWL為模板，在 95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，68 ℃、10 s，72 ℃、30 s，30 個循環(huán)的 PCR反應條件下，高保真擴增出帶同源臂的coEWL基因的ORF 區(qū)段。在In-fusion clone 酶作用下將其克隆到pPIC9K 中，構(gòu)建重組表達載體pPIC9K-coEWL(見圖1)。

在42℃條件下，將重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細胞中。用Kan+Amp 雙抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒抽提后進行雙酶切驗證，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，檢驗其構(gòu)建是否正確。具體操作參見畢赤酵母多拷貝表達載體試劑盒說明書。

圖1 重組表達載體pPIC9K-coEWL 的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression vector pPIC9K-coEWL

1.2.2 電轉(zhuǎn)化、高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定

選用SalI 酶切測序正確的重組表達載體pPIC9K-coEWL，獲得線性質(zhì)粒，利用同源重組將其整合至酵母基因組中。取OD600（酵母菌體在600 nm 處的光密度）為1.2 左右的酵母菌體20 mL，在8 mL混合溶液（10 mmol·L-1Tris-HCl， pH6.0，10 mmol·L-1LiAc， 0.6 mol·L-1山梨醇， 10 mmol·L-1DTT）中室溫靜置 30 min[13]；4 ℃ 2 000 r·min-1離心，收集沉淀，用 1 mol·L-1山梨醇溶液清洗 3 次，最后添加 1 mol·L-1山梨醇溶液溶解 80 μL，制得酵母感受態(tài)細胞。取約10 ng 線性質(zhì)粒與酵母感受態(tài)細胞混合，1.5 kV 電擊后立即添加800 μL 山梨醇溶液，復蘇1 h，涂布MD 平板，初步篩選His+轉(zhuǎn)化子。

用無菌水沖洗MD 平板上生長的酵母菌落，將菌液稀釋 104倍 ，并涂 布于梯度 G418（1～15 mg·mL-1）-YPD 平板上，選擇高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。隨機選取長勢良好的酵母轉(zhuǎn)化子，放于單克隆YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取200 μL 培養(yǎng)液離心，棄上清液，滅菌后用 ddH2O 清洗，沉淀 3 次，最后添加 50 μL無菌水混勻。取1 μL 上清作為菌落PCR 的模板，以α-Factor 和 3'AOX1序列作為引物 ，PCR 條 件 為95 ℃ 、5 min，95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30 個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠鑒定PCR 擴增產(chǎn)物。

1.2.3 重組酵母G-p-coEWL的誘導表達

挑選陽性酵母重組子（G-p-coEWL）單菌落，接種于 50 mL BMGY 培養(yǎng)基中，28 ℃，240 r·min-1培養(yǎng)18 h，離心后獲得沉淀菌體。選取適量菌體，重懸于250 mL BMMY 培養(yǎng)基中，使菌液起始OD600在1.0 左右，相同條件下培養(yǎng)96 h。期間每隔12 h 取出5 mL 發(fā)酵液作為分析樣品，立即離心棄菌體，保留上清液，于－20℃保存?zhèn)溆?。同時向培養(yǎng)基添加適量體積無水甲醇，且維持甲醇濃度為0.5%。

1.2.4 表達蛋白的定性分析與酶活檢測

取1 mL 上清液，用三氯乙酸(TCA)脫鹽處理，然后進行SDS-PAGE 凝膠電泳。首先在樣品中添加上清0.11 mL 的TCA 溶液，混勻于－20 ℃過夜，冷丙酮清洗沉淀，晾干加水溶解沉淀，添加上清緩沖液，98 ℃、5 min，即得電泳上樣樣品。配置15%分離膠以及5%濃縮膠，20A/板進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染液染色，乙酸脫色液脫色，觀察蛋白電泳結(jié)果。

Bradford 法測定發(fā)酵上清液中總蛋白濃度，配置牛血清蛋白（BSA）標準溶液，測定微球菌在595 nm 處的吸光度（A595）并繪制蛋白標準曲線，根據(jù)曲線計算發(fā)酵液蛋白量，詳細操作步驟參見TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 使用說明書。

采用比濁法[14]測定蛋清溶菌酶的酶活，以藤黃微球菌（ATCC4698）為指示菌，在溶菌酶的水解作用下，微球菌在450 nm 處的吸光度（A450）降低。一個溶菌酶的酶活單位被定義為在25 ℃、pH 6.2 條件下，使用藤黃微球菌懸濁液在450 nm 處引起吸光度每分鐘變化量為0.001 所需的溶菌酶量。稱取10～15 mg 藤黃微球菌溶于50 mL 無菌磷酸緩沖液（pH 6.2）中，傾斜混勻，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。用PBS 溶液校對空白，起始底物溶液的A450控制在0.70±0.1 內(nèi)。首先取蛋清溶菌酶標準品（Sigma，酶活 40 000 U·mg-1），用磷酸緩沖液（pH 6.2）配置濃度梯度為 1 000，500，250，125，50，25，0 U·mL－1的酶標準溶液，取 100 μL 酶標準溶液并與2.9 mL 菌懸液迅速混勻，記錄A450：反應1 min 為A1，反應3 min 為A2，計算吸光度每分鐘平均下降值以酶活為縱坐標，單位時間內(nèi)吸光度變化量為橫坐標，作蛋清溶菌酶酶活標準曲線。對發(fā)酵上清液做相同處理，根據(jù)酶活標準曲線計算酶活。

1.2.5 表達蛋白的純化及其效果評價

為提升純化效果，在37 ℃條件下，對發(fā)酵液上清做真空旋轉(zhuǎn)濃縮處理。取濃縮樣作為蛋白純化上樣樣品。蛋清溶菌酶的等電點在11.0～11.5，在緩沖液pH 為7.4 時帶正電荷，選用SP-Sepharose FF。蛋清溶菌酶的分子質(zhì)量約為14.4 kDa，據(jù)此選用Sephadex G-50 進行蛋白純化。同時用2 種方法對目的蛋白進行純化，并比較2 種方法的效果。

離子交換層析。填料經(jīng)HCl-NaOH 先后預處理后裝柱，用 20 mmol·mL-1磷酸鹽緩沖液（pH 為7.4）沖洗平衡，取 2 mL 濃縮樣品，PBS 緩沖液稀釋至10 mL，于4 ℃靜置2 h，使目的蛋白充分帶上正電荷。樣品以1 mL·min-1的速度在壓力泵上樣，再轉(zhuǎn)用緩沖液清洗(流速為2 mL·min-1)。電腦核酸蛋白檢測儀實時檢測并記錄洗脫液的A280，洗脫至基線后，依次用含 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol·mL-1NaCl的磷酸緩沖液梯度洗脫，流速不變。根據(jù)洗脫峰分別收集洗脫液，于－20 ℃過夜，成固體后，放于真空冷凍干燥機中凍干36 h，收集粉末即得蛋清溶菌酶初步純化產(chǎn)品。

分子篩層析。稱取15 g 填料煮沸，過夜冷卻后裝柱，4 mL 濃縮樣品上樣，流速 0.2 mL·min-1，選用0.1 mmol·L-1醋酸銨溶液（pH 為 7.2）作為洗脫液，電腦核酸蛋白檢測儀實時檢測并記錄A280，洗脫至基線。收集洗脫峰液體，于－20℃過夜，成固體后，真空干燥。取適量粉末溶解后進行SDS-PAGE 電泳，由條帶初步判定純化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清溶菌酶基因的密碼子優(yōu)化結(jié)果

蛋清溶菌酶基因的密碼子與經(jīng)優(yōu)化后替換為堿基的基因比對，如圖2 所示，同時添加了終止子TGA。圖中，* 表示堿基一致，為半保守突變，空格表示保守突變?？梢妼⒌扒迦芫富蛱鎿Q為畢赤酵母所偏好的密碼子后，更符合酵母自身的翻譯體系，表達量可能會有所增加。

2.2 重組表達載體pPIC9K-coEWL 的構(gòu)建

通過設計與畢赤酵母表達載體pPIC9K 具有同源區(qū)段的引物，以優(yōu)化后的合成基因片段為模板，通過高保真PCR 擴增出帶同源臂的coEWL基因的ORF 區(qū)段，獲得422 bp 目的基因片段，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3 所示。采用無縫克隆技術(shù)連接至酶切后pPIC9K 線性空載體，構(gòu)建真核表達載體pPIC9K-coEWL。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamHI、SalI 雙酶切后，得到 2 614 bp 和 7 037 bp 目的基因片段，結(jié)果如圖4 所示。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pPIC9K-coEWL構(gòu)建正確。

圖2 蛋清溶菌酶序列與優(yōu)化后基因比對Fig.2 Alignment of egg white lysozyme sequence and optimized gene

圖3 coEWL PCR 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR product of coEWL M：DL2 000 標志物，1：雙酶切條帶。

2.3 酵母轉(zhuǎn)化子的篩選

電轉(zhuǎn)化后的酵母菌液在MD 平板上初步篩選出His+轉(zhuǎn)化子，如圖5 所示，用無菌水清洗MD 平板上的菌落后，轉(zhuǎn)涂G418 濃度梯度平板，30 ℃培養(yǎng)2～3d。鑒于酵母菌長勢良好，逐步提升G418 濃度，考慮遺傳霉素的高抗性可能與高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生有關(guān)，最終在濃度為 15 mg·mL－1的 G418 YDP 平板上隨機選取多個轉(zhuǎn)化子，進行菌落PCR 驗證。按上述方法制得模板，pPIC9K 通用引物擴增出的產(chǎn)物，電泳凝膠結(jié)果如圖6 所示，其中2 200 bp 左右條帶為 GS115 野生型的 AOX1 基因，890 bp 左右條帶為目的基因片段（393 bp）與 pPIC9K 上 AOX1 基因（492 bp）之和，結(jié)果表明，攜帶有優(yōu)化蛋清溶菌酶基因的線性化質(zhì)粒已經(jīng)重組到酵母基因組內(nèi)，而且此菌株為Mut+型，可以有效利用甲醇進行發(fā)酵表達。將此菌株命名為G-p-coEWL，作為發(fā)酵表達菌株。

圖5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子平板鑒定Fig.5 Identification of Pichia pastoris transformant

圖6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子菌落PCR 驗證Fig.6 PCR product of Pichia pastoris transformant

2.4 重組菌株的誘導表達

G-p-coEWL首先利用BMGY 培養(yǎng)基培養(yǎng)足夠量菌體，24～36 h 后取適量經(jīng)離心后的菌體，重懸于250 mL BMMY 培 養(yǎng)基中 ，起始 OD600控制在 1.0 左右。誘導96 h，離心收集發(fā)酵上清液。經(jīng)TCA 處理后，用SDS-PAGE 分析，可以觀察到在14.4 kDa 處有逐漸變濃的條帶，此為目的條帶，如圖7 所示。24 h 后蛋清溶菌酶開始表達，且表達量逐漸上升。

圖7 發(fā)酵上清液蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant protein

2.5 蛋清溶菌酶的酶活測定

按照上述試驗方法繪制蛋清溶菌酶酶活標準曲線，測定取樣樣品酶活。以發(fā)酵時間為橫坐標，每12 h 樣品酶活為縱坐標作圖，其結(jié)果如圖8 所示。由圖8 可知，在250 mL 搖瓶發(fā)酵表達中，酶活在36 h 處提升較明顯，這可能與酵母自身系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)。72 h 后酶活趨于平穩(wěn)，甚至有所降低。發(fā)酵上清液中酶活最高約為677 U·mL－1。

圖8 發(fā)酵上清酶活變化Fig.8 Lysozyme activity of supernatant

2.6 蛋白的定量分析及純化

首先，繪制BSA 標準曲線，然后，取96 h 發(fā)酵上清液20 μL 與考馬斯染液反應，測得A595平均值為0.169，最后，根據(jù)BSA 標準曲線計算得到G-p-coEWL的發(fā)酵上清液中總蛋白濃度為0.607 mg·mL-1。

在陽離子柱純化過程中，第一次上樣后將未吸附蛋白洗脫液重復過柱，110 min 回歸基線。換濃度梯度NaCl 緩沖液洗脫，每個濃度都在洗脫20 min 左右后出現(xiàn)洗脫峰，洗脫1 h 后換下一濃度溶液，最后高濃度清洗所有雜蛋白。從洗脫峰體積看，2 mL 樣品中未吸附蛋白占比較大，為80%左右。這與填料體積以及最大吸附量有關(guān)。0.2 mol·L-1NaCl 溶液洗脫液中含有清晰的目的蛋白條帶，同時含有其他雜蛋白條帶。此pH 值下多種蛋白條帶電荷相同。濃度為0.1 mol·L-1的洗脫峰面積大于濃度為0.2 mol·L-1的，說明洗脫峰體積與蛋白含量無直接關(guān)系。使用Sephadex G-50 純化目的蛋白，共洗脫14.5 h。2 h 左右時出現(xiàn)第 1 正蛋白峰，5.25 h 時出現(xiàn)第2 疊加蛋白峰，此時吸光度還未降至零，11.13 h時出現(xiàn)面積較大的第3 峰，直到洗脫結(jié)束A280回到基線。

從純化后蛋白的SDS-PAGE 分析圖（見圖9）可知，樣品在過Sephadex G-50 柱子后，對目的蛋白的分離效果更佳，最終在14.4 kDa 處得到了單一的目的蛋白條帶。而離子柱下經(jīng)各濃度NaCl 溶液洗脫后的蛋白條帶并不單一，沒有達到很好的分離效果。

圖9 純化后蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified protein

3 討 論

巴斯德畢赤酵母作為較成熟的真核蛋白表達體系，已實現(xiàn)500 多種外源蛋白的表達，各種蛋白表達量暫不能完全滿足市場需求[9]。研究人員針對此問題提出一系列解決對策，包括優(yōu)化密碼子、改造信號肽、添加強啟動子等。本實驗參照酵母菌屬的密碼子偏好性，通過改變外源目的基因的部分堿基序列（精氨酸序列不變），理論上可以提高在酵母細胞中的轉(zhuǎn)錄翻譯頻率，提高外源蛋白的表達量。YANG等[15]將黑曲霉的2 型脂肪酶基因理性優(yōu)化后，在畢赤酵母中獲得了191 U·mL-1的表達量，在原16.5 U·mL-1的水平上提升了近10 倍。本實驗首先對蛋清溶菌酶的密碼子進行優(yōu)化，替換了106 個堿基，氨基酸序列未改變，旨在提高外源基因在酵母細胞中的轉(zhuǎn)錄效率。

在制備酵母感受態(tài)細胞過程中，相比于原實驗方法中只使用山梨醇溶液浸泡清洗酵母菌體，本實驗首先采用混合處理液對酵母細胞進行浸泡，再經(jīng)山梨醇溶液清洗獲得酵母感受態(tài)細胞，其他電轉(zhuǎn)化條件不變。原方法幾乎沒有篩選出轉(zhuǎn)化子。改進實驗方法后，最終得到了一株可抗高濃度G418（15 mg·mL-1）的轉(zhuǎn)化子G-p-coEWL。在現(xiàn)有可見報道中，電轉(zhuǎn)化獲得酵母重組子可抗G418 的濃度最高為5 mg·mL-1[16]。畢赤酵母高拷貝表達試劑盒手冊中提到，可抗?jié)舛葹? mg·mL-1G418 的酵母轉(zhuǎn)化子體內(nèi)拷貝數(shù)達7～12 個，高抗性的產(chǎn)生可能與外源基因插入的拷貝數(shù)有關(guān)[17]。在G-p-coEWL中需要插入的外源基因拷貝數(shù)有待通過RT-PCR 等實驗進一步探究。

重組酵母菌G-p-coEWL，經(jīng)搖瓶發(fā)酵雖能成功表達溶菌酶蛋白，但產(chǎn)量和活性沒有達到理想的發(fā)酵水平，可能與發(fā)酵方式和發(fā)酵參數(shù)未優(yōu)化有關(guān)，以此為基礎，后期通過優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)（特別是通氣條件）或采用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，預計發(fā)酵水平可以提高50～100 倍。張洋[18]將海參i-型溶菌酶及基因優(yōu)化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母進行發(fā)酵表達，在搖瓶條件下只獲得了8.79 U·mL-1的表達產(chǎn)物，采用5 L 發(fā)酵罐表達后，酶活提高了近52 倍。另外，G-p-coEWL菌株為Mut+型，能高效利用甲醇進行外分泌表達，發(fā)酵周期比Mut-型菌株縮短近一半，目的蛋白外分泌表達也使后期發(fā)酵產(chǎn)品純化更簡單，這些優(yōu)勢極大地降低了溶菌酶的生產(chǎn)成本，對溶菌酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有至關(guān)重要的意義。

同時，本文比較了Sephadex G-50 和SPSepharose FF 這兩種純化方法，可以看出樣品在過Sephadex G-50 柱后，對目的蛋白的分離效果更佳，但是Sephadex G-50 柱花費時間較長，所以仍需尋找合適的蛋白分離方法。