鐘煒祥，韋晰鳳，溫 群

(1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科； 2.贛州市婦幼保健院門診部，江西 贛州 341000)

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因是肺癌分子靶向治療的主要靶點(diǎn)，與目前廣泛應(yīng)用于臨床的吉非替尼、厄洛替尼及?？颂婺岬刃》肿覧GFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)敏感性顯著相關(guān)，在肺腺癌的治療中顯示出很好的抗腫瘤療效[1-2]。在中國(guó)，EGFR基因突變存在顯著的地域差異，目前贛南地區(qū)尚無相關(guān)報(bào)道。本研究通過DNA測(cè)序結(jié)合擴(kuò)增耐突變系統(tǒng)(ARMS)法檢測(cè)贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況并分析其與肺腺癌患者性別、吸煙情況及TNM分期等臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌EGFR基因突變的特點(diǎn)，為篩選最合適的肺癌患者進(jìn)行EGFR-TKIs治療提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科、腫瘤科及呼吸內(nèi)科于2016年1月至2017年12月經(jīng)外科手術(shù)切除(30例)或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢(78例)或電子支氣管鏡活檢(18例)組織標(biāo)本126例，均通過組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肺腺癌。其中男69例(54.76%),女57例(45.24%)；年齡33～78歲，中位年齡60歲；無吸煙史72例(57.14%)，有吸煙史54例(42.86%)；按國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)(第八版)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期12例(9.52%)、Ⅱ期8例(6.35%)，Ⅲ期32例(25.40%)，Ⅳ期74例(58.73%)。入組患者遍布贛南地區(qū)十八縣市區(qū)，均為初治，未行靶向及放化療。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本固定和DNA提取

由醫(yī)院病理科常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋固定，按至少5 μm厚度切取病理白片5～10張外送。126例組織標(biāo)本按時(shí)間先后分成2組，一組(2016年)含81例樣本外送至上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，另一組(2017年)含45例樣本外送至浙江鼎晶醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司。采用QIAamp DNA FFPE提取試劑盒(QIAGEN)提取樣本DNA，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度。

1.2.2 EGFR基因突變檢測(cè)

上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所采用DNA測(cè)序法，先將抽提好的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物、相應(yīng)的試劑和設(shè)計(jì)的引物一起加入3730/3130基因測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，最后將得到的基因序列與Genbank中的EGFR基因標(biāo)準(zhǔn)序列(序列號(hào)：NG_007726)進(jìn)行比對(duì)，分析測(cè)序結(jié)果；浙江鼎晶醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司采用ARMS-PNA(肽核酸)技術(shù)檢測(cè)EGFR基因第18、19、20、21外顯子突變，具體操作方法參照人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(武漢海吉力生物科技有限公司，注冊(cè)證書編號(hào)：3400973)說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS24.0軟件，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因外顯子18、19、20及21突變分析

在126例標(biāo)本中，檢測(cè)出64例EGFR基因突變，突變率為50.79%。其中，19外顯子突變(Exon19)45例，占突變病例70.3%(45/64)，均為delE746-A750(即19del)；21外顯子(Exon21)突變14例，占突變病例21.9%(14/64)，均為L(zhǎng)858R(2573T→G)；18外顯子(Exon18)突變2例，占突變病例3.1%(2/64)，均為G719A(C→G)；Exon21、外顯子20(Exon20)二聯(lián)突變2例，突變類型為L(zhǎng)858R+T790M；Exon19、Exon20二聯(lián)突變1例，突變類型為19delE746-A750+T790M。見表1和圖1—2。

表1 EGFR突變分析 n=64

2.2 EGFR基因突變與肺癌各臨床病理特征的關(guān)系

女性患者突變率66.7%(38/57)明顯高于男性37.7%(26/69)，不吸煙患者突變率59.7%(43/72)明顯高于吸煙患者38.9%(21/54)，兩者之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EGFR突變?cè)谀挲g分布和TNM分期方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 贛南地區(qū)肺腺癌患者EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系 n=106

2.3 EGFR基因19del、L858R突變與肺癌各臨床病理特征的關(guān)系

EGFR基因19del、L858R突變患者在性別、年齡、吸煙狀況以及TNM分期方面進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 EGFR外顯子19、21突變與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

目前肺癌的治療已邁入“精準(zhǔn)醫(yī)療”時(shí)代，EGFR基因是目前研究最透徹的分子靶點(diǎn)。EGFR基因位于7號(hào)染色體短臂7p12—14區(qū)，由28個(gè)外顯子組成，其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18—24編碼,使用TKIs的有效性與EGFR外顯子18—21突變有關(guān)[3-4]。基因突變位于EGFR酪氨酸激酶活性區(qū)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)，TKIs通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)，阻止酪氨酸殘基磷酸化，從而阻止EGFR信號(hào)通路的傳導(dǎo)，最終達(dá)到抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等一系列腫瘤細(xì)胞生物活動(dòng)[5]，進(jìn)而有效治療EGFR基因突變的肺癌患者。因此，EGFR突變可以作為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者EGFR-TKIs治療敏感性的預(yù)測(cè)因子，通過檢測(cè)EGFR突變的情況可以指導(dǎo)靶向用藥及針對(duì)性的個(gè)體化治療。本研究結(jié)果顯示，贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌EGFR基因突變率為50.79%(64/126)，女性、不吸煙患者突變率明顯高于男性、吸煙患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與國(guó)內(nèi)[6]、外[4]文獻(xiàn)報(bào)道相似，進(jìn)一步證實(shí)了EGFR突變多見于女性且不吸煙肺腺癌患者。

目前為止所發(fā)現(xiàn)的EGFR突變均發(fā)生于EGFR基因的外顯子18—21，其中19del和L858R為其最常見突變類型，約占NSCLC中所有EGFR突變類型的85%左右[7]。本研究納入126例病例，其中19del突變45例，占突變病例70.3%(45/64)；21外顯子突變(均為L(zhǎng)858R)14例，占突變病例21.9%(14/64)；18外顯子突變(均為G719A)2例，占突變病例3.1%(2/64)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，19del突變均為核苷酸序列中第2235—2249位堿基缺失，導(dǎo)致EGFR蛋白第746—750位氨基酸丟失，簡(jiǎn)稱delE746-A750；L858R突變則是外顯子21第858位密碼子發(fā)生堿基(T→G)替換突變，引起第2573位亮氨酸(L)轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?R)；G719A突變指第719位的甘氨酸被丙氨酸(G719A)取代。此外，第20外顯子T790M突變指外顯子20中第790氨基酸位點(diǎn)的蘇氨酸(T)被甲硫氨酸(M)替代，基因水平表現(xiàn)是ACG突變成ATG。未經(jīng)EGFR-TKIs治療的NSCLC病例檢測(cè)到T790M基因突變稱為原發(fā)T790M突變，常常與其他EGFR位點(diǎn)突變同時(shí)出現(xiàn)，據(jù)文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道，70%～80%合并L858R，其次為19del。本研究檢測(cè)出3例第20外顯子點(diǎn)突變，均為原發(fā)T790M突變，其中2例聯(lián)合L858R突變，1例聯(lián)合19del突變，此結(jié)果與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道一致。多項(xiàng)研究[10]證實(shí)，原發(fā)T790M突變會(huì)降低一代EGFR-TKIs的療效，奧希替尼作為第三代EGFR-TKIs可同時(shí)作用于EGFR活性突變和T790M耐藥突變[11]。

據(jù)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，四川[6]、云南宣威地區(qū)[12]EGFR基因突變以21外顯子為主，湖南[13]、廣東[14]地區(qū)EGFR基因突變以19外顯子為主，上海[15]、安徽[16]、廣西南寧[17]地區(qū)則以19外顯子和21外顯子為主，且兩者之間沒有區(qū)別。本研究表明贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌中EGFR突變以19del突變?yōu)橹?，與湖南、廣東地區(qū)報(bào)道的一致，進(jìn)一步證實(shí)了中國(guó)大陸各地區(qū)之間EGFR基因突變類型存在顯著差異，可能與遺傳背景、民族、環(huán)境等因素有關(guān)。隨著EGFR-TKIs在敏感突變的NSCLC患者中的廣泛應(yīng)用,目前關(guān)于不同類型的EGFR突變對(duì)EGFR-TKIs敏感性不同的研究[18-20]較多，比較公認(rèn)的是19del突變較L858R突變患者對(duì)TKIs的治療更敏感。本研究結(jié)果顯示贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌患者中19del突變多見，提示在EGFR-TKIs治療中獲益更大。亞組分析了EGFR基因19del和L858R突變?cè)谮M南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌患者性別、年齡、吸煙狀況及TNM分期方面，均無明顯差異。

本研究不同時(shí)間段采取DNA測(cè)序和ARMS法進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。2016年入組的病例送至上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所采取直接測(cè)序法，具有直觀、準(zhǔn)確性和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)已知和未知突變，是EGFR基因突變檢測(cè)的常用方法。為保證標(biāo)本中腫瘤組織含量，尤其是活檢小標(biāo)本如經(jīng)皮肺穿刺或電子支氣管鏡活檢組織標(biāo)本，要求病理科切取病理白片時(shí)須保障白片厚度至少5 μm，且規(guī)定活檢小標(biāo)本送檢10張白片，手術(shù)切除標(biāo)本送檢5張白片。同時(shí)在組織DNA提取后使用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為DNA濃度不低于20 ng·μL-1，OD260/OD280在1.8～2.0之間。通過以上措施來提高突變檢測(cè)率，克服測(cè)序法靈敏度不高的缺點(diǎn)。2017年入組的病例送至浙江鼎晶醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司，采用ARMS-PNA技術(shù)，結(jié)合熒光PCR平臺(tái)，檢測(cè)人類EGFR基因上的30種不同的突變。與測(cè)序法相比，ARMS檢測(cè)方法靈敏度更高，檢測(cè)周期更短，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能檢測(cè)到DNA中含量低至1%的突變基因。不足之處是當(dāng)ARMS法檢出外顯子突變，需結(jié)合測(cè)序法才能明確具體的突變位點(diǎn)和突變類型。本研究中，45例病例采用DNA測(cè)序法檢測(cè)出23例EGFR突變，68例病例采用ARMS法檢測(cè)出33例EGFR突變，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.72，P=0.788)。其余13例病例同時(shí)采取DNA測(cè)序和ARMS法進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌患者EGFR基因突變率較高，與患者的性別、吸煙狀況相關(guān)，主要見于女性、不吸煙患者，突變類型以19del突變?yōu)橹?，提示更能從EGFR-TKIs治療中獲益。明確贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌患者EGFR基因突變的特點(diǎn)，指導(dǎo)贛南地區(qū)肺癌患者個(gè)體化治療，為贛南地區(qū)篩選最合適的肺癌患者進(jìn)行EGFR-TKIs治療提供臨床依據(jù)，進(jìn)而建立贛南地區(qū)肺癌靶向治療模式并推廣應(yīng)用于臨床。

致謝：

感謝上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所和浙江鼎晶醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司在本研究EGFR基因突變檢測(cè)方面提供的幫助。