劉 蕾，王君蘭，王 星

(1.內(nèi)江市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 內(nèi)江 641000； 2.成都市第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，成都市呼吸健康研究所，成都 610000； 3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

支氣管哮喘是一種2型免疫應(yīng)答為主的慢性氣道炎癥性疾病，全球約3億患者被支氣管哮喘所困擾，最新的研究[1]顯示我國(guó)20歲及以上哮喘患病人數(shù)達(dá)4570萬(wàn)之多，其中還未統(tǒng)計(jì)咳嗽變異性哮喘(CVA)等特殊類(lèi)型哮喘，因此哮喘是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)多發(fā)病。有調(diào)查[2]顯示，美國(guó)每年用于支氣管哮喘的防治費(fèi)用甚至高過(guò)肺結(jié)核及艾滋病治療支出之和，在歐盟全年支氣管哮喘的花費(fèi)超過(guò)百億歐元，因而支氣管哮喘對(duì)社會(huì)、家庭和個(gè)人都帶來(lái)了沉重的疾病負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。氣道黏液高分泌是哮喘主要的病理生理改變之一，尤其在重癥哮喘和致死性哮喘發(fā)病機(jī)制和增加死亡率中起重要作用。控制氣道的慢性炎癥是哮喘治療的核心，目前的臨床上哮喘氣道炎癥控制主要依靠糖皮質(zhì)激素治療，但存在不良反應(yīng)等問(wèn)題限制其應(yīng)用，并且缺乏顯著減輕哮喘氣道黏液過(guò)度分泌的藥物。

蘇黃止咳膠囊包含麻黃、紫蘇葉、蜜枇杷葉、炒紫蘇子、五味子、地龍、蟬蛻、前胡、炒牛蒡子9種中藥成分，全國(guó)多中心隨機(jī)對(duì)照研究和大量臨床實(shí)踐均證明蘇黃止咳膠囊對(duì)CVA有較好的療效[3]。但其對(duì)哮喘氣道炎癥和黏液高分泌的作用和機(jī)制目前尚不清楚，基于此，本研究通過(guò)構(gòu)建塵螨誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型，探討蘇黃止咳膠囊對(duì)其氣道炎癥和黏液分泌的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠(6～8周)購(gòu)于成都達(dá)碩公司，塵螨(HDM)購(gòu)于丹麥ALK公司，蘇黃止咳膠囊(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)，批號(hào)：18040311)，Imject?Alum佐劑、cDNA合成試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾公司，兔抗小鼠IgE和MUC5AC多抗購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司，iQTMSYBR?Green超混合液購(gòu)于伯樂(lè)公司，劉氏染液和H&E染色試劑盒購(gòu)于珠海貝索公司，免疫組化二抗購(gòu)于武漢博士德公司，小鼠IL-4、IL-5和IL-13細(xì)胞因子ELISA試劑盒購(gòu)于杭州聯(lián)科生物公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)于上海飛捷公司，MUC5AC引物(F：5′-GCCAAGTGCCAAAAGCAGTAGAG-3；R：5′-GACCTGGGGTGTGGGTAGAAGA-3)和GAPDH引物(F：5′-ACCTGCCAAGTATGATGACATCA-3；R：5′-GGTCCTCAGTGTAGCC-CAAG-AT-3)合成于上海生工公司。

1.2 分組、哮喘模型構(gòu)建與給藥

將30只雌性C57BL/6J小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(PBS組)、哮喘組(Asthma組)和治療組(SH組)，每組10只。哮喘組和治療組分別在第0天和第7天進(jìn)行腹腔注射HDM 20 μg和Imject?Alum佐劑(終體積1:1)，對(duì)照組腹腔注射相同體積PBS溶液。在第14天予以HDM 40 μg滴鼻激發(fā)，1次·d-1，連續(xù)7 d，其中治療組小鼠于每次激發(fā)前2 h予蘇黃止咳膠囊藥粉3.5 g·kg-1(溶于200 μL PBS溶液)灌胃[4]，哮喘組和對(duì)照組均以PBS溶液代替處理。

1.3 氣道高反應(yīng)性(AHR)檢測(cè)

末次激發(fā)后24 h，將各組C57BL/6J小鼠分別放入無(wú)創(chuàng)全身體描檢測(cè)系統(tǒng)(WBP)，測(cè)定基線增強(qiáng)呼氣間歇(Penh)值后予分別霧化6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1的乙酰甲膽堿(Mch)并記錄各只小鼠Penh值。

1.4 血清收集

測(cè)量AHR 24 h后，各只小鼠摘除眼球取血收集于1.5 mL EP管中，待血液凝固后吸取血清，儲(chǔ)存于超低溫冰箱待檢。

1.5 支氣管肺泡灌洗液(BALF)獲取及細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)

各組小鼠氣管切開(kāi)后予氣管插管，注入800 μL預(yù)冷PBS溶液，緩慢來(lái)回抽吸5次，每只小鼠重復(fù)3次。肺泡灌洗液1500 r·min-1離心15 min后棄去上清液，以500 μL PBS溶液重懸沉淀細(xì)胞，取重懸液20 μL計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。再取PBS細(xì)胞懸液200 μL滴于載玻片進(jìn)行劉式染色，光鏡下分類(lèi)計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞。

1.6 肺組織HE染色及PAS染色

分離各組小鼠肺組織后10%中性甲固定，常規(guī)包埋切片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行肺組織切片H&E染色和PAS染色。

1.7 肺組織免疫組織化學(xué)染色

肺組織石蠟切片至水后放入高壓修復(fù)3 min，正常山羊血清37 ℃濕盒封閉40 min，再滴加1:200稀釋的兔抗鼠MUC5AC抗體4 ℃過(guò)夜，PBS溶液洗3 min，重復(fù)3次，使用3%雙氧水/甲醇溶液封閉20 min后PBS溶液洗3 min，重復(fù)3次，加入羊抗兔二抗工作液于37 ℃孵育40 min，PBS溶液洗10 min，重復(fù)3次，隨后滴入SABC于37 ℃孵育30 min，PBS溶液洗3 min，重復(fù)3次，滴入DAB顯色后水洗蘇木精復(fù)染，封片后光鏡下觀察。

1.8 肺組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR

無(wú)菌分離各組小鼠肺組織，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用RNAfast200總RNA提取試劑盒提取總RNA，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按iQTMSYBR?Green超混合液說(shuō)明書(shū)配置20 μL反應(yīng)體系上機(jī)：95 ℃預(yù)變性3 min→95 ℃變性15 s→57 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s→采集熒光，40個(gè)循環(huán)后溶解曲線55～95 ℃(增量0.5 ℃)15 s。使用2-△△Ct法相對(duì)定量分析結(jié)果。

1.9 ELISA法檢測(cè)塵螨特異性IgE(HDM-sIgE)

96孔板用1 μg·mL-1HDM+CBS抗原包被液每孔100 μL 4 ℃包被過(guò)夜，PBST溶液清洗5 min，重復(fù)3次，隨后每孔200 μL封閉液(3%牛血清白蛋白)于37 ℃封閉2 h，使用1%牛血清白蛋白按1:5稀釋血清，每孔加入100 μL稀釋血清于37 ℃孵育2 h，PBST溶液清洗5 min，重復(fù)3次，隨后用1%牛血清白蛋白按1:2000稀釋IgE抗體，加入后37 ℃孵育2 h，PBST溶液清洗5 min，重復(fù)3次，加入100 μL TMB后37 ℃條件下避光孵育15 min，最后2 mol·L-1硫酸滴入終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值。

1.10 原代脾細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞因子檢測(cè)

超凈工作臺(tái)內(nèi)分離各組小鼠脾臟，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液，加入RBC裂解液裂解后，1500 r·min-1離心(4 ℃)5 min，使用含10%FBS和雙抗的RPMI1640重懸，5×106每孔濃度加入無(wú)菌24孔板，每孔再加入200 μg HDM后37 ℃條件下孵育72 h后離心，上清按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-4、IL-5和IL-13細(xì)胞因子濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 氣道高反應(yīng)性

通過(guò)塵螨過(guò)敏原構(gòu)建C57BL/6J小鼠哮喘模型，使用WPB系統(tǒng)檢測(cè)末次激發(fā)24 h后各組小鼠在各濃度Mch刺激下的增強(qiáng)呼氣間歇值，結(jié)果見(jiàn)圖1，Asthma組Penh值明顯高于PBS組(均P<0.05)，表明本研究成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)氣道高反應(yīng)；SH組Penh值較Asthma組顯著降低(均P<0.05)，表明蘇黃止咳膠囊可改善塵螨誘導(dǎo)的小鼠氣道高反應(yīng)性。

2.2 肺組織切片HE染色

PBS組小鼠氣道上皮完好齊整，很少見(jiàn)到炎癥細(xì)胞，管腔通暢，Asthma組小鼠氣道以及血管旁可見(jiàn)炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，支氣管上皮可見(jiàn)缺損壞死脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)到有局部黏液栓形成；而SH組上述肺部改變顯著減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管上皮得到恢復(fù)(圖2)。表明塵螨過(guò)敏原成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)氣道炎癥，蘇黃止咳膠囊可減輕小鼠氣道炎癥病變。

2.3 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)

小鼠BAL F沉淀細(xì)胞PBS重懸后行劉氏染色，光鏡下炎癥細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)可見(jiàn)Asthma組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)數(shù)量明顯高于PBS組(P<0.05)，SH組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量較Asthma組顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3—4。表明塵螨抗原刺激誘導(dǎo)小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，而蘇黃止咳膠囊可減少其氣道嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4 肺組織切片PAS染色

Asthma組PAS糖原染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于PBS組，SH組杯狀細(xì)胞則比Asthma組顯著減少(圖5)。表明塵螨誘導(dǎo)小鼠氣道黏液高分泌，蘇黃止咳膠囊可減輕哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生和黏液高分泌。

2.5 肺組織MUC5AC mRNA的表達(dá)

Asthma組肺MUC5AC mRNA表達(dá)水平顯著高于PBS組(P<0.05)，而SH組比Asthma組顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖6。表明蘇黃止咳膠囊可下調(diào)塵螨誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道MUC5AC的mRNA表達(dá)。

2.6 氣道MUC5AC蛋白的表達(dá)

MUC5AC蛋白顯示為棕黃染色，Asthma組陽(yáng)性染色明顯強(qiáng)于PBS組，SH組陽(yáng)性染色則比Asthma組減少(圖7)。表明蘇黃止咳膠囊可減少哮喘小鼠氣道MUC5AC蛋白表達(dá)。

2.7 塵螨特異性IgE檢測(cè)

Asthma組血清HDM-sIgE含量顯著高于PBS組(P<0.05)，而SH組血清HDM-sIgE含量比Asthma組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8。表明塵螨誘導(dǎo)小鼠HDM-sIgE升高，蘇黃止咳膠囊可減少HDM-sIgE分泌。

2.8 脾細(xì)胞上清液細(xì)胞因子檢測(cè)

Asthma組IL-4、IL-5和IL-13水平較PBS組顯著升高(均P<0.05)；SH組IL-5和IL-13水平較Asthma組顯著降低(P<0.05)，IL-4水平略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖9—11。

3 討論

蘇黃止咳膠囊包含9種中草藥成分，以麻黃為君藥，宣散肺中之邪，平喘止咳；紫菀和五味子為臣藥，收斂肺氣，化痰止咳；紫蘇子和前胡等為佐，既可強(qiáng)化麻黃的疏風(fēng)作用，又能增加升降相協(xié)之能力；再配合地龍和蟬蛻等疏散風(fēng)邪、利咽止癢為使[5]。有研究[6-7]證實(shí)蘇黃止咳膠囊對(duì)CVA有較好的療效，可降低哮喘氣道AHR，還有報(bào)道其具有調(diào)節(jié)免疫的功能，可糾正患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群紊亂。程莉等[8]證明蘇黃止咳膠囊能協(xié)同改善老年COPD患者肺功能，并通過(guò)降低血清中IL-6和IL-8水平調(diào)節(jié)非特異性氣道炎癥。

哮喘氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)包括EOS、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，其中EOS在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病中發(fā)揮十分重要的作用[9]。本研究通過(guò)成功復(fù)制塵螨誘導(dǎo)哮喘小鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)蘇黃止咳膠囊治療后，小鼠BAL F中炎細(xì)胞計(jì)數(shù)和EOS數(shù)目顯著下降，氣道炎癥浸潤(rùn)明顯減少，同時(shí)氣道高反應(yīng)性得到了明顯改善，證實(shí)了其對(duì)塵螨誘導(dǎo)氣道炎癥和高反應(yīng)性的改善作用。

黏液分泌亢進(jìn)是哮喘患者，尤其是重癥哮喘患者發(fā)病和死亡率增加的重要原因。氣道黏液分泌的主要蛋白成分是粘蛋白，主要由杯狀細(xì)胞分泌。哮喘患者氣道黏液高分泌主要表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞增生并分泌大量MUC5AC粘蛋白，這與氣流受限和AHR也密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，PAS染色顯示蘇黃止咳膠囊治療后，小鼠氣道中杯狀細(xì)胞增生明顯減輕，同時(shí)粘蛋白MUC5AC的蛋白表達(dá)水平以及mRNA水平均得到不同程度的抑制，證明蘇黃止咳膠囊可以減輕塵螨過(guò)敏原誘導(dǎo)的氣道黏液過(guò)度分泌。

哮喘的主要發(fā)病機(jī)制之一是2型輔助T淋巴細(xì)胞(Help T cell 2，Th2)數(shù)目增多和功能亢進(jìn)，Th2細(xì)胞參與宿主對(duì)于細(xì)胞外病原的免疫防御，主要分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13[10-11]。白細(xì)胞介素4和13能誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生大量sIgE抗體，sIgE進(jìn)一步結(jié)合到嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的高親和力受體上，當(dāng)其再次接觸同種過(guò)敏原，引發(fā)下游炎癥介質(zhì)瀑式放大，產(chǎn)生平滑肌痙攣、黏液分泌亢進(jìn)等反應(yīng)，表現(xiàn)為哮喘臨床癥狀發(fā)生[12]。有研究[13]證實(shí)過(guò)表達(dá)IL-13可成功構(gòu)建過(guò)敏性哮喘小鼠模型，下調(diào)IL-13能減輕哮喘氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和黏液高分泌。IL-5又稱(chēng)嗜酸性粒細(xì)胞集落刺激因子，是調(diào)節(jié)EOS增殖活化的重要因子，可促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞分泌白三烯和組織胺等炎癥介質(zhì)。使用單克隆抗體阻斷IL-5通路可顯著減輕小鼠肺組織的EOS浸潤(rùn)，改善病毒誘發(fā)的哮喘惡化[14]。為了進(jìn)一步探究蘇黃止咳膠囊減輕氣道高反應(yīng)和黏液高分泌的機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)蘇黃止咳膠囊治療雖然IL-4的表達(dá)水平?jīng)]有顯著降低，但可以有效減少I(mǎi)L-13和IL-5的表達(dá)，抑制B淋巴細(xì)胞合成釋放塵螨特異性IgE抗體，減輕嗜酸性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性和黏液高分泌。初步證實(shí)了蘇黃止咳膠囊對(duì)過(guò)敏性氣道炎癥和黏液過(guò)度分泌的療效機(jī)制，為進(jìn)一步從復(fù)合配方中尋找新的小分子藥物控制哮喘提供了方向。