李治綱 韓彩平 鄭麗麗 史迎新 古再麗努爾阿卜杜柯尤木 劉珊珊

摘 要 目的：探討新疆維吾爾族急性冠脈綜合征（ACS）患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板反應性的相關性。方法：選取2018年1月-2019年1月新疆喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院心血管內科收治的維吾爾族ACS患者90例，予阿司匹林+氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療且出院后持續(xù)用藥1年。檢測患者血小板聚集抑制率（DPAI），評價其對氯吡格雷的反應性。采用聚合酶鏈式反應（PCR）-熒光探針法檢測其CYP2C19*2、*3基因分型，采用PCR-直接測序法檢測其CYP2C19*17基因分型。采用多因素? ? ?Logistic回歸分析探討基因和非基因因素與患者DPAI的相關性。結果：90例患者中，氯吡格雷抵抗（CR）的患者有10例，非CR患者有80例。CYP2C19*2 G/G、G/A、A/A型患者分別有58、28、4例，CYP2C19*3 G/G、G/A型患者分別有88、2例，CYP2C19*17 C/C、C/T型患者分別有64、26例，各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。治療后，CYP2C19*2 G/A、A/A型患者DAPI均較G/G型患者顯著降低，且A/A型患者DAPI顯著低于G/A型患者（P<0.05）;CYP2C19*17 C/T型患者DAPI較C/C型患者顯著升高（P<0.05）;而CYP2C19*3 G/A與A/A型患者DAPI比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。多因素Logistic回歸分析結果顯示，CYP2C19基因多態(tài)性與新疆維吾爾族ACS患者DPAI獨立相關[比值比=2.314，95%置信區(qū)間（1.569，3.144），P=0.009]，而年齡、性別、吸煙等非基因因素與DPAI無關（P>0.05）。結論：CYP2C19基因多態(tài)性與新疆維吾爾族ACS患者氯吡格雷抗血小板反應性有關，*2野生型患者可能具有更高的DPAI，而*17野生型患者可能具有更低的DPAI。

關鍵詞 氯吡格雷;CYP2C19;基因多態(tài)性;血小板聚集抑制率;急性冠脈綜合征;維吾爾族

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the correlation between CYP2C19 gene polymorphisms and antiplatelet reactivity of clopidogrel in Xinjiang Uygur patients with acute coronary syndrome （ACS）. METHODS： Totally 90 Uygur patients with ACS who were admitted to the cardiovascular department of Xinjiang Kashi Second Peoples Hospital from Jan. 2018 to Jan. 2019 were selected as the study subjects. They were given anti-platelet therapy of asprin+clopidogrel， and received the treatment continuously for one year after discharge. The platelet aggregation inhibition （DPAI） rate of the patients were determined， and the response to clopidogrel was evaluated. PCR-fluorescence probe method was used to detect genotype of CYP2C19*2 and *3， and PCR-direct sequencing method was used to detect genotype of *17. Multivariate Logistic regression analysis was adopted to investigate the correlation of gene and non-gene factors with DPAI of patients. RESULTS： Among 90 patients， there were 10 patients with clopidogrel resistance （CR） and 80 patients with non-CR. There were 58， 28 and 4 patients with CYP2C19*2 G/G， G/A， A/A genotype， respectively; there were 88 and 2 patients with CYP2C19*3 G/G， G/A genotype， respectively; there were 64 and 26 patients with CYP2C19*17 C/C， C/T genotype， respectively; the genotype frequency of each genotype was consistent with Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）. After treatment， DAPIs of patients with CYP2C19*2 G/A， A/A genotype were decreased significantly， while those of the patients with A/A genotype were significantly lower than patients with G/A genotype patients （P<0.05）. DAPIs of patients with CYP2C19*17 C/T genotype were increased significantly， compared with C/C genotype patients （P<0.05）. There was no statistical significance in DAPIs between CYP2C19*3 G/A and A/A genotype patients （P>0.05）. Multivariate Logistic regression analysis showed that CYP2C19 gene polymorphism was independently related to DPAI in Xinjiang Uygur patients with ACS [OR=2.314， 95%CI （1.569， 3.144）， P=0.009]， while age， gender， smoking and other non-gene factors were not related to DPAI （P>0.05）. CONCLUSIONS： CYP2C19 gene polymorphism is associated with antiplatelet reactivity of clopidogrel in Xinjiang Uygur patients with ACS. *2 wild type patients may have higher DPAI， while *17 wild type patients may have lower DPAI.

KEYWORDS? ?Clopidogrel; CYP2C19; Gene polymorphism; Platelet aggregation inhibition rate; Acute coronary syndrome; Uygur nationality

急性冠脈綜合征（Acute coronary syndrome，ACS）是一種臨床上常見的嚴重的心血管疾病。在西方國家，由ACS造成的死亡人數(shù)高達總死亡人數(shù)的1/3;在我國，ACS的發(fā)病率和病死率呈逐年上升的趨勢，已成為嚴重危害人類健康的流行病之一[1]。目前，阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷進行抗血小板治療是經(jīng)皮冠狀動脈介入術ACS患者預防術后缺血事件再次發(fā)生的經(jīng)典治療方案[2]。然而由于個體差異，部分患者會出現(xiàn)氯吡格雷抵抗（Clopidogrel resistance，CR），即療效不佳[3]。氯吡格雷是一種前體藥物，需要經(jīng)肝臟中的細胞色素P450酶（CYP）代謝生成活性產(chǎn)物才能發(fā)揮藥效。有證據(jù)表明，CYP同工酶亞型CYP2C19編碼基因的突變與氯吡格雷療效差異密切相關[4]。針對不同人種的研究發(fā)現(xiàn)，該基因*2、*3突變會降低CYP2C19酶的活性，導致氯吡格雷不能被有效激活，從而降低藥物的治療效果;而*17突變則會增加CYP2C19酶的表達，更有利于藥物療效的發(fā)揮[5]。

我國已經(jīng)開展了有關漢族ACS患者氯吡格雷療效與CYP2C19基因多態(tài)性的相關性研究，且初步證實在氯吡格雷療效不佳的漢族患者中，CYP2C19*1/*2型的分布頻率較高[6]。宋博凡[7]研究了新疆維吾爾族人群CYP2C19*2基因多態(tài)性的分布情況，發(fā)現(xiàn)該類人群中CYP2C19*2各型分布頻率與我國漢族人群以及歐洲人群均有明顯差異;另外，李振[8]對我國南疆地區(qū)維吾爾族人群CYP2C19基因型分布情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)該類人群CYP2C19慢代謝型（*2/*2、*3/*3、*2/*3）的分布頻率為4.17%，明顯低于漢族人群的13.64%。但新疆維吾爾族ACS患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板反應性是否存在關聯(lián)尚不清楚。為此，本研究擬初步評價新疆維吾爾族ACS患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板反應性的相關性，以期為該藥的臨床個體化應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入標準：符合2014年美國心臟協(xié)會（AHA）與心臟病學學會（ACC）聯(lián)合發(fā)布的ACS診斷標準[9]，主要包括非ST段抬高型心肌梗死等;入選前均未服用過氯吡格雷或噻氯匹定，亦未使用過肝素;年齡>18歲，性別不限;維吾爾族。排除標準：具雙聯(lián)抗血小板治療禁忌證及器械過敏者;服用非甾體或甾體抗炎藥者;出血體質者;近1個月內存在大手術史和深部穿刺介入史者;妊娠期或哺乳期婦女。本研究共選取2018年1月-2019年1月喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院心血管內科收治的ACS患者90例為研究對象。

1.2 治療方法與療效判定

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。入院后，所有患者均接受標準的雙聯(lián)抗血小板藥物治療：第1日口服負荷劑量阿司匹林腸溶片（意大利Bayer S.p.A.公司，注冊證號：H20130078，規(guī)格：100 mg）300 mg，qd+硫酸氫氯吡格雷片[深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，批準文號：國藥準字H20000542，規(guī)格：25 mg（以C16H16ClNO2S計）]300 mg，qd;第2日起口服維持劑量阿司匹林腸溶片100 mg，qd+硫酸氫氯吡格雷片75 mg，qd，并予出院后持續(xù)服用1年。

于治療第5日患者晨起給藥前，空腹抽取其外周靜脈血2 mL，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管中，于-80 ℃凍存，用于基因型檢測。另同法抽取患者靜脈血3 mL，置于含3.13%枸櫞酸鈉的采血管中，使用CFMS LEPU-8800型血栓彈力圖儀[樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司]檢測血小板聚集抑制率（DPAI），該檢測須在采血后2 h內完成，并將最大DPAI<20%定義為CR[3]。

1.3 基因型檢測

取“1.2”項下凍存的外周靜脈血樣品，采用核酸提取試劑盒（磁珠法）（深圳聯(lián)合醫(yī)學科技有限公司）提取DNA，采用聚合酶鏈反應（PCR）-熒光探針法檢測患者CYP2C19*2（rs4244285）、CYP2C19*3（rs4986893）分型，利用PCR-直接測序法檢測CYP2C19*17（rs12248560）分型。PCR擴增于ABI 7500型熒光PCR儀（美國Applied Biosystems公司）上完成，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司設計、合成（序列見表1，其中F、R分別為上、下游引物，P1、P2分別為野生型、突變型匹配探針）。（1）PCR-熒光探針法。PCR反應體系（共40 μL）：DNA模板5.0? ?μL，上、下游引物各0.8 μL，10×Ex Taq Buffer 4.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，野生型匹配探針0.4 μL，突變型匹配探針0.4 μL，Takara Ex Taq酶0.5 μL，滅菌ddH2O 24.1 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，適宜溫度下（CYP2C19*2為60 ℃，CYP2C19*3為62 ℃）退火45 s，共40個循環(huán)。分型鑒定：根據(jù)樣品在相應檢測通道內達到特定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct）是否為40～45來判斷*2或者*3的分型。（2）直接測序法。PCR反應體系（共40? ?μL）：DNA產(chǎn)物5.0 μL，上、下游引物各1.2 μL，10×Ex Taq Buffer 4.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，Takara Ex Taq酶0.5 μL，滅菌ddH2O 24.1 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃再延伸3 min，共30個循環(huán)。分型鑒定：將產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序并通過Sequence Scanner 2.0軟件確定分型。其中，CYP2C19*2、*3、*17的野生型均為*1/*1（681G/G、636G/G、-806C/C），突變雜合型分別為*1/*2（681G/A、636G/G、-806C/C）、*1/*3（681G/G、636G/A、-806C/C）、*1/*17（681G/G、636G/G、 -806C/T），突變純合型分別為*2/*2（681A/A、636G/G、? ?-806C/C）、*3/*3（681G/G、636A/A、-806C/C）、*17/*17（681G/G、636G/G、-806T/T）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用JMP Pro 10.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05。對研究對象一般人口學、既往病史、行為因素等因素進行一般性描述。采用Shapiro-Wilk檢驗分析計量數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若符合正態(tài)分布的以x±s表示，采用LSD-t檢驗;非正態(tài)分布的以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，經(jīng)對數(shù)轉換后，采用χ2檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，采用χ2檢驗。采用Fishers精確檢驗或χ2檢驗分析各基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用多因素Logistic回歸分析基因和非基因因素對患者DPAI的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

本研究共納入維吾爾族ACS患者90例，肝、腎功能均正常。其中，男性69例（76.7%）、女性21例（23.3%）;存在吸煙史的有20例，存在飲酒史的有10例;伴高血壓的有36例，伴糖尿病的有26例。90例患者中，CR的有10例，非CR的有80例，CR發(fā)生率為11.1%;CR和非CR患者的一般臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。

2.2 CYP2C19基因型分布

90例患者中，CYP2C19*2野生G/G型有58例（64.4%），突變雜合型G/A型有28例（31.1%），突變純合型A/A型有4例（4.4%），等位基因G、A的頻率分別為80.0%、20.0%。CYP2C19*3野生G/G型有88例（97.8%），突變雜合型G/A型有2例（2.2%），未檢測到突變純合A/A型，等位基因G、A的頻率分別為98.9%、1.1%。CYP2C19*17野生C/C型有64例（71.1%），C/T型有26例（28.9%），未檢出突變純合T/T型，等位基因C、T的頻率分別為85.6%、14.4%。CYP2C19*2、*3、*17各位點基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

2.3 CYP2C19基因型和氯吡格雷反應性的相關性

治療前，CYP2C19*2、*3、*17不同基因型患者年齡、性別、吸煙/飲酒史、合并癥、WBC等一般臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性（詳略）。治療后，CYP2C19*2 G/A、A/A型患者DAPI均較G/G型患者顯著降低，且A/A型患者DAPI顯著低于G/A型患者（P<0.05）;CYP2C19*17 C/T型患者DAPI較C/C型患者顯著升高（P<0.05）;而CYP2C19*3 G/A、A/A型患者DAPI比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表3。

2.4 多因素Logistic分析結果

以DPAI為因變量，以患者年齡、性別、吸煙/飲酒史、高血壓、糖尿病和CYP2C19基因多態(tài)性為自變量進行多因素Logistic分析。結果，新疆維吾爾族ACS患者CYP2C19基因多態(tài)性與DPAI獨立相關[比值比（OR）=2.314，95%CI（1.569，3.141），P=0.009]，而其余因素均與患者DPAI無關（P>0.05），詳見表4（表中，以CYP2C19基因各位點野生型為對照，評價該基因突變對患者DPAI的影響）。

3 討論

目前，國外有關氯吡格雷代謝功能缺失基因（CYP2C19*2、*3）和功能增強基因（CYP2C19*17）多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關性研究較多;國內也已有較多關于上述基因多態(tài)性的小樣本研究報道，但主要基于漢族健康人群或漢族冠心病患者[10-11]，而涉及維吾爾族ACS患者的相關研究較為鮮見。

有證據(jù)表明，CYP2C19功能型等位基因突變與個體氯吡格雷反應性差異存在明顯的關聯(lián)[12]。該基因至少存在14個突變位點，其中*2、*3、*17是其主要的突變體。CYP2C19*2是最常見的酶缺陷型突變位點之一，其位于第5外顯子的堿基突變（681G→A）可導致翻譯時丟失215～227個氨基酸，最終合成無催化活性的酶;CYP2C19*3為第4外顯子的堿基突變（636G→A），可使212位色氨酸密碼子提前生成終止密碼子，使得酶合成提前完成，所合成的酶催化活性降低;CYP2C19*17位于5′側翼區(qū)域的-806C>T處，該位點突變可使得CYP2C19基因轉錄增強，從而增加酶的表達量[13]。

本研究結果顯示，維吾爾族ACS患者中的CYP2C19*2位點A等位基因頻率為20.0%，與宋博凡[7]研究中新疆維吾爾族人群CYP2C19*2位點基因多態(tài)性的分布情況基本一致。秦延海等[14]研究顯示，漢族ACS患者CYP2C19*2位點3種基因型（G/G、G/A、A/A型）頻率分別為42.0%、41.7%、8.3%，與本研究中的64.4%、31.1%、4.4%不同，提示維吾爾族ACS患者的突變率略低于漢族ACS患者。本研究共檢出CYP2C19*3位點的2種基因型，即G/G、G/A型，分別有88、2例，與熱依汗·依明[15]的研究結果基本一致;共檢出CYP2C19*17位點的2種基因型，即C/C、C/T型，分別有64、26例，C、T等位基因頻率分別為85.6%、14.4%，與袁圓等[16]研究中新疆維吾爾族人群的基因型分布特征基本一致，但與該地區(qū)漢族人群的分布明顯不同（漢族人群C、T等位基因頻率分別為99.6%、0.4%）。

目前，新疆維吾爾族ACS患者CYP2C19*2、*3、*17基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板反應性之間是否存在關聯(lián)尚未見報道。為此，本研究在檢測ACS患者基因分型的基礎上，采用血栓彈力圖儀檢測了患者的DPAI，初步分析了上述基因多態(tài)性與患者DPAI的相關性。結果顯示，治療后，CYP2C19*2 G/A、A/A型患者DAPI均較G/G型患者顯著降低，且A/A型患者DAPI顯著低于G/A型患者，提示該位點突變可降低患者DPAI，增加其CR發(fā)生的概率。CYP2C19*3 G/G型與G/A型患者的DPAI無顯著差異，提示該位點突變可能與其DPAI無關。CYP2C19*17 C/T型患者DAPI顯著高于C/C型患者，提示該位點突變可提高患者DPAI，降低其CR發(fā)生的概率，但有增加出血風險的可能。多因素Logistic分析結果也表明，與其他非基因因素（年齡、性別等）相比，CYP2C19基因多態(tài)性是影響維吾爾族ACS患者氯吡格雷療效最為重要的獨立影響因素。

綜上所述，本研究共納入了90例新疆維吾爾族ACS患者，考察了CYP2C19基因多態(tài)性與其氯吡格雷抗血小板反應性的相關性，為新疆維吾爾族患者的個體化治療提供了參考。但本研究樣本量較少，特別是*3的突變例數(shù)極少，且有關CYP2C19*3基因多態(tài)性與患者氯吡格雷療效的關聯(lián)性以及*2、*3突變是否可與*17突變相互抵消等還有待大樣本、多中心臨床研究來進一步探討。

參考文獻

[ 1 ] SAYDAM F，DE?IRMENCI ?，BIRDANE A，et al. The CYP2C19*2 and CYP2C19*17 Polymorphisms play a vital role in clopidogrel responsiveness after percutaneous coronary intervention：a pharmacogenomics study[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol，2017，121（1）：29-36.

[ 2 ] DAVIS KA，MIYARES MA，DIETRICH E. Dual antipla- telet therapy with clopidogrel and aspirin after ischemic stroke：a review of the evidence[J]. Am J Health Syst Pharm，2015，72（19）：1623-1629.

[ 3 ] BHOPALWALA AM，HONG RA，KHAN ZR，et al. Routine screening for CYP2C19 polymorphisms for patients being treated with clopidogrel is not recommended[J]. Hawaii J Med Public Health，2015，74（1）：16-20.

[ 4 ] HORENSTEIN RB，MADABUSHI R，ZINEH I，et al.? Effectiveness of clopidogrel dose escalation to normalize active metabolite exposure and antiplatelet effects in CYP2C19 poor metabolizers[J]. J Clin Pharmacol，2014，54（8）：865-873.

[ 5 ] W?JCIK T，SZYMKIEWICZ P，WI?NIEWSKI J，et al. Distribution of polymorphisms in the CYP2C19 and ABCB1 genes among patients with acute coronary syndrome in lower Silesian population[J]. Adv Clin Exp Med，2019，28（12）：1621-1626.

[ 6 ] 黃麗云，符青，陳冬琳. CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷抗血小板治療療效的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2019，39（6）：624-627.

[ 7 ] 宋博凡.攜帶CYP2C19*2、*3功能缺失型等位基因漢族與維吾爾族患者PCI術后使用高劑量氯吡格雷的療效對比[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學，2016.

[ 8 ] 李振.新疆漢族與維吾爾族心腦血管疾病患者CYP2C19基因多態(tài)性分析[D].石河子：石河子大學，2015.

[ 9 ] AMSTERDAM EA，WENGER KW，BRINDIS RG，et al. 2014 AHA/ACC guideline for the management of patients with non-ST-elevation acute coronary syndromes：a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J]. J Am Coll Cardiol，2014，64（24）：e139-e228.

[10] 倪貴華.氯吡格雷代謝相關的基因多態(tài)性與腦梗死患者的血小板反應性和缺血性事件的關聯(lián)研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2018.

[11] DAI DP，HU LM，GENG PW，et al. In vitro functional analysis of 24 novel CYP2C19 variants recently found in the Chinese Han population[J]. Xenobiotica，2015，45（11）：1030-1035.

[12] RAGIA G，GIANNAKOPOULOU E，KARAGLANI M，et al. Frequency of CYP450 enzyme gene polymorphisms in the Greek population：review of the literature，original findings and clinical significance[J]. Drug Metabol Drug Interact，2014，29（4）：235-248.

[13] CUI H，LIN S，CHEN X，et al. Correlation between SNPs in candidate genes and verifynow-detected platelet responsiveness to aspirin and clopidogrel treatment[J]. Cardiovasc Drugs Ther，2015，29（2）：137-146.

[14] 秦延海，古麗扎爾·買買提明，等.維吾爾族、哈薩克族、漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分析[J].重慶醫(yī)學，2015，44（33）：4632-4634.

[15] 熱依汗·依明.漢族、維吾爾族人群氯吡格雷代謝相關CYP2C19基因多態(tài)性分析[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學，2014.

[16] 袁園，趙軍，郁長治，等.新疆漢族和維吾爾族人群細胞色素P450 2C19*17基因的單核苷酸多態(tài)性研究[J].中國臨床藥理學雜志，2017，33（16）：1546-1548.

（收稿日期：2020-01-19 修回日期：2020-06-08）

（編輯：張元媛）