劉雯 侯晨輝 李江

摘 要 目的：研究沙苑子總黃酮（TFA）對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的雄性生殖功能障礙模型大鼠的改善作用及機(jī)制。方法：將雄性SD大鼠分為空白組、模型組、陽(yáng)性組（五子衍宗丸，2 g/kg）和TFA低、中、高劑量組（0.05、0.1、0.2 g/kg），每組12只。各組雄性大鼠每日早上9：00灌胃相應(yīng)藥物，并于同日下午3：00灌胃腺嘌呤混懸液以復(fù)制生殖功能障礙模型（空白組除外），連續(xù)給藥35 d。給藥結(jié)束后，將各組雄性大鼠與雌性大鼠按1 ∶ 1合籠交配7 d后取出，檢測(cè)致雌鼠受孕率;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)雄性大鼠血清中睪酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平;摘取雄性大鼠睪丸、附睪、精囊腺、胸腺、腎，并計(jì)算其臟器指數(shù);采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察雄性大鼠睪丸、附睪及腎組織的病理學(xué)變化;采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)雄性大鼠腎組織中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組雄性大鼠致雌鼠受孕率，睪丸、附睪、精囊腺、胸腺指數(shù)，血清中T、E2、SOD、GSH-Px水平，腎組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;腎指數(shù)和血清中FSH、LH、MDA、Scr、 BUN水平，腎組織中 Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;睪丸組織中生精小管直徑變細(xì)、間距較寬，生精細(xì)胞排列紊亂;附睪管管壁增厚、排列疏松、間質(zhì)增大，管腔增生萎縮、腔內(nèi)精子聚集成團(tuán);腎組織中腎間質(zhì)纖維增生，腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量黃色結(jié)晶。與模型組比較，陽(yáng)性組和TFA中、高劑量組雄性大鼠致雌鼠受孕率，睪丸、附睪、精囊腺、胸腺指數(shù)，血清中T、E2、SOD、GSH-Px水平，腎組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），腎指數(shù)和血清中FSH、LH、MDA、Scr、 BUN水平，腎組織中 Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TFA低劑量組上述指標(biāo)變化趨勢(shì)相同，且大部分有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）;各給藥組雄性大鼠睪丸、附睪、腎組織病理學(xué)變化均明顯減輕。結(jié)論：TFA對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的雄性大鼠的生殖障礙具有顯著改善作用，其機(jī)制可能與降低性激素FSH、LH水平和下調(diào)腎組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，升高性激素T、E2水平和改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 沙苑子總黃酮;生殖功能障礙;性激素;氧化應(yīng)激;機(jī)制;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of Astragalus complanatus total flavonoids （TFA） on adenine-induced reproductive dysfunction model male rats and its mechanism. METHODS： Male SD rats were divided into blank group， model group， positive group （Wuzhi yanzong pill， 2 g/kg）， TFA high-dose， medium-dose and low-dose groups （0.05， 0.1， 0.2 g/kg）， with 12 rats in each group. Male rats in each group were given the corresponding drugs intragastrically at 9：00 a.m. every day， while the model of reproductive dysfunction was reproduced by intragastric administration of adenine suspension （except for blank group） at 3：00 p.m. on the same day， for consecutive 35 days. After medication， male rats in each group were mated with female rats by ratio of 1 ∶ 1 in cages; 7 days later， inducing-pregnancy rate of male rats were measured. ELISA assay was used to detect the serum levels of T， E2， FSH， LH， GSH-Px， SOD， MDA， Scr and BUN in male rats; the testis， epididymis， seminal vesicle， thymus and kidney of male rats were extracted and the organ index was calculated; HE staining was used to observe the pathological changes of testis， epididymis and kidney; the protein expression of Bcl-2， Bax， Caspase-3 and Caspase-9 in the renal tissue of male rats were detected by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with blank group， the inducing-pregnancy rate of male rats， the testis， epididymis， seminal vesicle gland， thymus indexes， the serum levels of T， E2， SOD and GSH-Px， the protein expression levels of Bcl-2 in renal tissue were reduced significantly in model group （P<0.01）; the renal index， the serum levels of FSH， LH， MDA， Scr and BUN， the protein expression levels of Bax， Caspase-3 and Caspase-9 in renal tissue were increased significantly （P<0.01）; the diameter of seminiferous tubules in testis became thinner， the spacing was wider， and the arrangement of seminiferous cells was disordered; the wall of epididymis was thickened， the arrangement was loose， the stroma was enlarged， the lumen was proliferated and atrophied， and the sperm in the lumen wass aggregated; in renal tissue， interstitial fibers was proliferated， and a large number of yellow crystals were seen in renal tubules. Compared with model group， the inducing-pregnancy rate， the testis， epididymis， seminal vesicle gland， thymus indexes， the serum levels of T， E2， SOD and GSH-Px， the protein expression levels of Bcl-2 in renal tissue of male rats were increased significantly in the positive group， TFA medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）， while the renal index， the serum levels of FSH， LH， MDA， Scr and BUN， the protein expression levels of Bax， Caspase-3 and Caspase-9 in renal tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; there was the same chage trend and most with significant difference in above indexes of TFA low-dose group （P<0.05 or P<0.01）; the pathalogic changes of testis， epididymis and renal tissue were improved significantly. CONCLUSIONS： TFA can significantly improve adenine-induced reproductive dysfunction model male rats. The mechanism may be associated with reducing hormone FSH and LH level， the expression of apoptosis-related proteins in renal tissue， while increasing the level of hormone T and E2 and improving oxidant stress level.

KEYWORDS? ?Astragalus complanatus total flavonoids; Reproductive dysfunction; Horone; Oxidant stress; Mechanism; Rat

近年來(lái)，隨著環(huán)境污染加劇、生活節(jié)奏加快及生育年齡延遲，不育癥患者數(shù)量急劇增加，發(fā)病率逐年上升，對(duì)人類生殖繁衍造成巨大影響[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，男性不育癥占所有不孕不育癥的35%～50%，其中弱精子癥是導(dǎo)致男性不育癥的重要因素，其病因機(jī)制尚未完全明確，且治療手段與可選擇的藥物較少[2]，因此，研發(fā)防治男性生殖功能障礙的新型藥物是目前的熱點(diǎn)之一。

目前，西醫(yī)在治療弱精子癥方面雖有一定成果，但仍有部分患者的治療效果不盡人意，尚缺乏特效藥物[3]。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精而主生殖，當(dāng)腎精腎氣充足、精室充盈，方能孕育生命，因此在治療男性不育時(shí)，當(dāng)先從腎著手[4-5]。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪（Astragalus complanatus R. Brown.）的干燥成熟種子，性味甘、溫，歸肝、腎經(jīng);具有溫補(bǔ)肝腎、固精、縮尿、明目之功效，其腎助陽(yáng)之功效頗為顯著;主要用于治療腎虛腰痛、遺精早泄、遺尿尿頻、白濁帶下、眩暈、目暗昏花等[6]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)成分主要有黃酮類、三萜皂苷類、脂肪酸、氨基酸、揮發(fā)油、甾醇類等，對(duì)血壓、腦血流量、免疫功能和血液流變均有影響，且具有解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、耐寒、抗疲勞、抗炎和降脂保肝的作用[7]。陳勤[8]研究發(fā)現(xiàn)，沙苑子總黃酮（TFA）能顯著升高酗酒模型小鼠睪丸、附睪指數(shù)，并增加其精子數(shù)量和活力，降低精子的畸變率，這提示TFA對(duì)酗酒模型小鼠的生精功能和精子細(xì)胞損傷有一定的改善效果。本研究采用腺嘌呤灌胃雄性大鼠復(fù)制生殖功能障礙模型，探討TFA對(duì)雄性生殖障礙模型大鼠精子質(zhì)量、生育能力的影響，并通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中性激素雌二醇（E2）、睪酮（T）、促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）水平，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，腎功能指標(biāo)肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，腎組織中凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9蛋白表達(dá)水平等指標(biāo)變化，以期為治療男性生殖功能障礙的新藥研發(fā)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS-490型全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）;H1850R型高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;JJ-12J型脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）;RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）;Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）;BSA2245型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;HM-SY96A型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（山東食安生物科技有限公司）;Aperio A72數(shù)字病理系統(tǒng)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司]。

1.2 藥品與試劑

TFA[南京澤郎生物科技有限公司，含量：47.28%（即每100 g沙苑子提取物含總黃酮47.28 g）];五子衍宗丸（江西藥都樟樹(shù)制藥有限公司，批號(hào)：20180415，規(guī)格：6 g/袋）;E2、T、FSH、LH、GSH-Px、SOD、MDA、Scr、BUN酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號(hào)分別為：E20181012A、E20181017A、E20181003A、E20181019A、E20181024A、E20181028A、E20180922A、E20181018A、E20181016A）;兔抗大鼠 Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠Bax單克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-9多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為：ab32124、ab32503、ab13847、ab32539）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（北京力高泰科技有限公司，批號(hào)：ab205718）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用試劑，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性、雌性SD大鼠各72只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性組（五子衍宗丸，2 g/kg，按人與大鼠體表面積折算，相當(dāng)于人臨床用藥劑量的10倍）和TFA低、中、高劑量組（0.05、0.10、0.20 g/kg，給藥劑量參考文獻(xiàn)方法[9]設(shè)置），每組12只。采用邊給藥邊造模的方式，各組大鼠于每日上午9：00灌胃相應(yīng)藥物（生理鹽水配制）;于同日下午3：00，除空白組不作處理外，其余各組大鼠灌胃腺嘌呤混懸液（200 mg/kg，以0.5%羧甲基纖維素鈉配制，臨用現(xiàn)配）復(fù)制雄性大鼠生殖功能障礙模型，連續(xù)給藥35 d[10-11]。大約第30天時(shí)模型組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、弓背、畏冷豎毛、尿量增加等情況時(shí)，表明模型建立成功。

2.2 各組大鼠精子質(zhì)量評(píng)價(jià)

末次給藥后，取雌性大鼠按1 ∶ 1比例與各組雄性大鼠合籠交配，7 d后取出雄性大鼠。雌性大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)14 d，并檢測(cè)受孕率（受孕率=受孕雌鼠數(shù)量/雌鼠總數(shù)量），以評(píng)價(jià)雄性大鼠的精子質(zhì)量。

2.3 各組大鼠血清中性激素、氧化應(yīng)激、腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

各組雄性大鼠交配完畢取出后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 mL，于4 ℃條件下以3 000? ?r/min離心15 min。取上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，檢測(cè)各組大鼠血清中E2、T、FSH、LH、GSH-Px、SOD、MDA、Scr、BUN水平。

2.4 各組大鼠臟器指數(shù)的檢測(cè)

各組雄性大鼠取血后，摘取其胸腺、睪丸、附睪、精囊腺、腎并稱定質(zhì)量，計(jì)算各臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.5 各組大鼠睪丸、附睪、腎組織病理學(xué)觀察

取“2.4”項(xiàng)下各組雄性大鼠的睪丸、附睪、腎組織適量，置于10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片（3～5 ?m），然后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察上述組織的病理學(xué)變化。

2.6 各組大鼠腎組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下各組雄性大鼠的腎組織切片，進(jìn)行脫蠟，水化，抗原修復(fù)，以10%山羊血清封閉抗原，加入Bax、Caspase-3單克隆抗體和Bcl-2、Caspase-9多克隆抗體（稀釋比例分別為1 ∶ 250、? ?1 ∶ 250、1 ∶ 500、1 ∶ 250），置于4 ℃條件下孵育18～24 h;以PBS洗滌2 min×3次，加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000），室溫孵育10 min;以PBS洗滌10 min×2次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，在顯微鏡下觀察顯色程度;以PBS洗滌5 min×3次，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸中分化，自來(lái)水沖洗，乙醇梯度脫水，干燥，中性樹(shù)脂封片。Aperio數(shù)字病理系統(tǒng)掃描切片并拍照，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性染色部分的光密度值，用來(lái)表示Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠精子質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

與空白組比較，模型組雄性大鼠致雌鼠受孕率顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，陽(yáng)性組和TFA低、中、高劑量組雄性大鼠致雌鼠受孕率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠精子質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠血清中性激素、氧化應(yīng)激、腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清中E2、T、SOD、GSH-Px水平均顯著降低（P<0.01），F(xiàn)SH、LH、MDA、Scr、 BUN水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性組和TFA中、高劑量組大鼠血清中E2、T、SOD、GSH-Px水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），F(xiàn)SH、LH、MDA、Scr、BUN水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TFA低劑量組上述指標(biāo)呈同樣變化趨勢(shì)，且大部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清中相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠臟器指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠腎指數(shù)顯著升高（P<0.01），睪丸、附睪、精囊腺、胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性組和TFA低、中、高劑量組腎指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01），睪丸、附睪、精囊腺、胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠臟器指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 各組大鼠睪丸、附睪、腎組織病理學(xué)觀察結(jié)果

空白組大鼠睪丸組織生精小管基膜完整，生精細(xì)胞排列規(guī)則，血管豐富，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育良好，近管腔處可見(jiàn)大量精子;附睪組織中附睪管排列緊密規(guī)則，管腔內(nèi)精子含量豐富、分布均勻;腎組織中腎小管內(nèi)無(wú)異物，腎單位清晰 。模型組大鼠睪丸組織生精小管直徑變細(xì)，間距較寬，生精細(xì)胞排列紊亂，生精上皮變薄且層次和數(shù)量均減少;附睪組織中附睪管管壁增厚、排列疏松、間質(zhì)增大，管腔增生萎縮、腔內(nèi)精子聚集成團(tuán);腎組織中腎間質(zhì)纖維增生，腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量黃色結(jié)晶，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、呈灶狀萎縮。陽(yáng)性組和TFA低、中、高劑量組睪丸組織生精小管基膜和生精上皮變薄，生精細(xì)胞排列規(guī)則，少數(shù)生精上皮與基底部分離;附睪組織中附睪管管壁變薄、排列緊密，管腔內(nèi)精子數(shù)量增多、分布均勻;腎組織中腎小管內(nèi)結(jié)晶減少，上皮細(xì)胞萎縮、間質(zhì)纖維化情況明顯減少。各組大鼠睪丸、附睪、腎組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

3.5 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性組和TFA中、高劑量組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TFA低劑量組上述指標(biāo)呈同樣變化趨勢(shì)，且大部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)染色顯微圖見(jiàn)圖4，蛋白水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

目前對(duì)男性生殖功能障礙的治療主要是通過(guò)藥物進(jìn)行干預(yù)，包括抗雌激素藥物、抗氧化劑、左旋肉毒堿等，雖取得了一定療效，但也存在一定副作用[12]。弱精子癥屬于中醫(yī)“精少”“精薄”“精冷”等范疇，中藥治療多以補(bǔ)腎陽(yáng)為主，如五子衍宗丸[由枸杞子、菟絲子（炒）、覆盆子、五味子（蒸）、車前子（鹽炒）等5味中藥組成]具有補(bǔ)腎益精的功效，臨床主要用于男性腎虛精虧所致不育癥[13]，基于此，本研究選擇其作為陽(yáng)性藥物。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TFA對(duì)大鼠生殖功能障礙具有一定的改善作用[8]，基于此，本研究通過(guò)灌胃腺嘌呤復(fù)制雄性大鼠生殖功能障礙模型，探討TFA對(duì)其生殖功能障礙的改善作用及可能機(jī)制。

精子的發(fā)生、成熟及睪丸的生精功能均受到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)和控制，性腺軸分泌的 FSH、LH和T直接調(diào)節(jié)人體性功能與生殖功能，以維持整個(gè)生育期的動(dòng)態(tài)平衡[14]。FSH是由垂體分泌并唯一作用于睪丸支持細(xì)胞的生殖激素，在男性成年期，F(xiàn)SH和抑制素B的分泌形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[15]。因此，血清中FSH水平高低可反映睪丸內(nèi)支持細(xì)胞的成熟狀態(tài)及其功能，當(dāng)FSH水平高于正常機(jī)體水平時(shí)，提示睪丸支持細(xì)胞功能異常。睪丸細(xì)胞受損首先會(huì)導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞-生精小管小管嵌合體受損，從而介導(dǎo)血清FSH水平升高，使血清中LH水平隨之代償性升高，影響精子密度[16]。本研究結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清中FSH、LH水平升高，T水平降低，表明模型大鼠睪丸細(xì)胞受損;當(dāng)給予五子衍宗丸和TFA后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清中FSH、LH水平降低，T水平升高，提示TFA對(duì)生殖障礙模型大鼠睪丸受損及性激素紊亂具有一定干預(yù)作用。

氧化還原系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控對(duì)精子的產(chǎn)生和男性生育力維持具有重要的調(diào)控作用，精原干細(xì)胞的自我更新需要活性氧（ROS）來(lái)維持，二倍體的精原細(xì)胞分化為單倍體精子細(xì)胞的過(guò)程也需要一定濃度的ROS[17]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS堆積時(shí)，會(huì)增加氧自由基含量，產(chǎn)生各種毒性作用，從而損害精子質(zhì)膜，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降[18]。SOD水平的高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA水平的高低又反映了機(jī)體細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度;GSH-Px是抗氧化酶類，為ROS的清除提供還原力，保護(hù)細(xì)胞免受傷害[19-20]。因此，檢測(cè)生殖障礙模型大鼠血清中SOD、GSH-Px及MDA水平具有一定的意義。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD、GSH-Px水平均顯著降低，MDA水平顯著升高，表明模型組大鼠抗氧化能力下降;當(dāng)給予五子衍宗丸和TFA后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清中SOD、GSH-Px水平顯著升高，MDA水平顯著降低，提示TFA可能通過(guò)增加機(jī)體抗氧化能力，改善生殖障礙模型大鼠的生精功能。

ROS大量產(chǎn)生還會(huì)增加正常組織細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡的風(fēng)險(xiǎn)[21]。本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，探討TFA對(duì)生殖障礙模型大鼠腎組織的改善作用。Bcl-2與Bax是最早被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)節(jié)因子，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡因子，Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子[22]。Caspase是細(xì)胞凋亡的核心，在死亡受體（Fas、DR4和DR5等） 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑即外源性激活途徑中，其效應(yīng)物Caspase-3被激活后將產(chǎn)生生物效應(yīng)。目前普遍認(rèn)為Caspase-9是凋亡的啟動(dòng)子，是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，處于Caspase“瀑布式”激活鏈的頂端，而Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者[23]。本研究結(jié)果顯示，TFA中、高劑量組大鼠Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明TFA可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)，從而改善腎損傷。

睪丸是產(chǎn)生精子和分泌生殖激素的重要器官，附睪的主要功能是存儲(chǔ)精子并促進(jìn)其功能成熟。本研究通過(guò)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠睪丸生精上皮變薄，生精細(xì)胞排列紊亂、層次和數(shù)量均減少; 附睪管管壁增厚、排列疏松，管腔增生萎縮，管腔內(nèi)精子聚集成團(tuán)，由此推測(cè)雄性大鼠性激素的紊亂可能與睪丸、附睪病變有關(guān)。經(jīng)TFA干預(yù)后，以上病理變化均有所改善，表明TFA可減輕雄性大鼠生殖功能損傷。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，生殖障礙患者多伴隨腎組織病理?yè)p傷，表現(xiàn)出腎功能不全[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組雄性大鼠腎組織出現(xiàn)大量棕黃色結(jié)晶;同時(shí)，腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中Scr、BUN水平也顯著升高。經(jīng)TFA干預(yù)后，大鼠腎組織病理?yè)p傷有所改善，血清中Scr、BUN水平顯著降低，表明TFA可明顯減輕大鼠腎組織病理學(xué)變化。

綜上所述，TFA對(duì)雄性大鼠生殖功能障礙具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與降低性激素FSH、LH水平和下調(diào)腎組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，升高性激素T、E2水平和改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

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（收稿日期：2020-04-07 修回日期：2020-05-13）

（編輯：唐曉蓮）