覃廣勝，趙朝步，陳明棠，黃 健，李 輝，譚正準(zhǔn)，鐘華配，黃加祥

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

水牛是一種重要的家畜資源，它在很多欠發(fā)達(dá)的農(nóng)業(yè)體系中占據(jù)著重要的位置，為人們提供奶、肉，也可作役力。水牛主要繁殖特點(diǎn)是超排反應(yīng)差[1]、可移植胚胎的回收率以及懷孕率低，同樣也存在青春期延遲、發(fā)情癥狀不明顯、季節(jié)性乏情期等[1]以及產(chǎn)后長(zhǎng)時(shí)間的乏情期[2-4]等生理特性問(wèn)題。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，活體采卵（OPU）和體外胚胎生產(chǎn)（IVEP）是目前生產(chǎn)可轉(zhuǎn)移胚胎（TE）的最具競(jìng)爭(zhēng)力的技術(shù)[5-8]。此外，可以利用OPU對(duì)非周期牛、懷孕奶牛以及輸卵管或生殖道感染的牛開(kāi)展研究[7,9]。也可以在對(duì)超排沒(méi)有反應(yīng)的動(dòng)物中進(jìn)行（尤其是水牛）[10]。因此，該方法是超排/胚胎移植（MOET）計(jì)劃的有效替代方案[8]。由于水牛對(duì)激素刺激的反應(yīng)低，胚胎回收率低[1,8,11]，而且不可能長(zhǎng)期重復(fù)MOET處理。因此，將OPU-IVEP技術(shù)應(yīng)用于水?？梢蕴岣吣赣H對(duì)遺傳改良的貢獻(xiàn)[8,11]，從而克服與水牛繁殖季節(jié)有關(guān)的效率降低的問(wèn)題。本研究探討了OPU重復(fù)次數(shù)對(duì)水牛卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響，旨在提高水牛胚胎的體外生產(chǎn)效率，為建立高效的水牛胚胎體外培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 如果無(wú)其他說(shuō)明，所有化學(xué)品和試劑（主要包括青霉素、鏈霉素、肝素鈉、TCM199培養(yǎng)基等）為Sigma公司生產(chǎn)。胎牛血清購(gòu)自Gibco BRL（Paisley，Scotland，UK）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和活體采卵程序 實(shí)驗(yàn)水牛選自廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)，共92頭水牛（摩拉27頭、尼里-拉菲30頭和雜交水牛35頭），4～12歲，體重580～700 kg?；铙w采卵程序按照?qǐng)?bào)道[5,7,12]方法進(jìn)行?；铙w采卵儀為日本Honda公司生產(chǎn)的HS2000 B型超聲波顯像儀；配有7.5/5.0 MHz扇形陰道掃描探頭（Aloka公司），19G采卵針（針長(zhǎng)60 cm，管長(zhǎng)120 cm，日本生產(chǎn)），真空泵（FHK，日本富士平公司），恒溫槽（日本富士平公司）；50 mL卵泡液收集管。穿刺前測(cè)定每個(gè)卵巢內(nèi)卵泡的數(shù)目和大小。將直徑≥3 mm卵泡穿刺，在真空壓力為50 mmHg的條件下，將卵泡液回收50 mL管收集管中。OPU每隔3 d進(jìn)行1次，連續(xù)進(jìn)行5次。

1.3 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體處理 采卵液含DPBS+3%胎牛血清+100 μg/mL青霉素+60 mg/mL鏈霉素+10 IU/mL肝素。TCM199培養(yǎng)基含5%NBS。根據(jù)卵丘細(xì)胞復(fù)合體（COCs）的形態(tài)特征，按張秀芳等[13]提出的方法對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。COCs可分為4類(lèi)：A級(jí)（有兩層以上卵丘細(xì)胞和均質(zhì)細(xì)胞質(zhì)的卵母細(xì)胞）；B級(jí)（至少有一層卵丘細(xì)胞和同質(zhì)細(xì)胞質(zhì)的卵母細(xì)胞）；C級(jí)（部分剝落的卵母細(xì)胞，但仍顯示胞質(zhì)均一）；D級(jí)（細(xì)胞質(zhì)不規(guī)則皺縮的退化卵母細(xì)胞）。A級(jí)和B級(jí)COCs在體外成熟培養(yǎng)基（TCM199+10%FBS+10 μg/mL FSH+12 U/mL LH+1 μg/mL E2+50 μmol/L半胱氨酸）中，于39℃、5%CO2濕化氣氛中培養(yǎng)22～24 h[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)計(jì)算連續(xù)OPU獲得的回收卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的比例。統(tǒng)計(jì)尼里-拉菲、摩拉以及雜交水牛不同批次回收回收卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的比例。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以不同批次為固定因子，A、B、C、D及頭均可視卵泡數(shù)為因變量，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，差異顯著的采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

表1顯示，連續(xù)5次活體采卵時(shí)，第1次卵母細(xì)胞回收率（65.91%）顯著高于第2～5次卵母細(xì)胞，而第2、3、4、第5次之間差異不顯著，這可能是第1次卵母細(xì)胞可穿刺的中等卵母細(xì)胞比第2～5次卵母細(xì)胞多，便于穿刺，回收率高，而第2～5次小卵泡多。優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（A+B級(jí)）1～5次的回收率分別為55.64%、64.05%、70.28%、69.30%、67.65%，優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的平均百分率為66.05%。進(jìn)行連續(xù)活體采卵時(shí)，第1、2次優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的百分率比第3、4、5次效果差，第1、2次的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的百分率與其他批次優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率差異顯著。第1次活體采卵回收C級(jí)卵母細(xì)胞（裸卵和網(wǎng)狀細(xì)胞）所占比例（39.76%）最大，與第2、3、4、5次差異顯著。隨著重復(fù)OPU次數(shù)的增加，D級(jí)卵母細(xì)胞（裸卵和網(wǎng)狀細(xì)胞）所占的比例不斷減少。

從表2可看出，尼里-拉菲水牛C級(jí)卵母細(xì)胞隨著活體采卵次數(shù)增加，所占的比例不斷減少，第1次活采所占的比例最大與第2、3、4、5次差異顯著；優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（A+B級(jí)）回收率第2、3、4、5次分別是70.49%、77.71%、69.80%、65.06%，顯著高于第1次回收率（52.50%）。摩拉水牛C級(jí)卵母細(xì)胞變化規(guī)律與尼里-拉菲水牛相近，第1次活體采卵C級(jí)回收率占比例達(dá)47.92%，與第2、3、4、5次差異顯著；優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（A+B級(jí)）回收率在48.43%～79.76%，第1次與第2、3、4、5次差異顯著。第1次卵母細(xì)胞回收效果最好（63.06%），與其余4次差異顯著。從表2也可看出，雜交水牛A級(jí)卵母細(xì)胞回收率比尼里-拉菲和摩拉水牛好，并且效果相對(duì)穩(wěn)定，而第1次的卵母細(xì)胞回收率（70.95%）與第2、3、4、5次差異顯著。總而言之，不同水牛品種在C級(jí)、優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞回收率和卵母細(xì)胞回收率不同。

3 討論

3.1 連續(xù)活體采卵對(duì)卵母細(xì)胞回收率的影響 卵母細(xì)胞回收率受多種因素影響，如活體采卵頻率等。黃右軍等[15]報(bào)道，第1次活體采卵回收率為78.5%，第2次回收率為62.0%，第3次為51.2%。梁賢威等[16]報(bào)道，連續(xù)活體采卵第1、2、3次采卵平均穿刺卵泡數(shù)和頭均回收的卵母細(xì)胞數(shù)雖存在差異，摩拉水牛卵母細(xì)胞回收率為70.02%，尼里-拉菲水牛為67.41%。而本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行連續(xù)5次活體采卵時(shí)，卵母細(xì)胞回收百分率比梁賢威等[16]的結(jié)果低（65.91%、48.16%、43.54%、50.77%和47.31%），但連續(xù)活體采卵，卵母細(xì)胞的回收率隨著采卵次數(shù)增加而呈下降趨勢(shì)，這與黃右軍等[15]報(bào)道的結(jié)果相近。陳明棠等[17]對(duì)富鐘水牛進(jìn)行活體采卵，發(fā)現(xiàn)隨著活體采卵次數(shù)增加，卵母細(xì)胞回收率下降。許紅喜等[18]對(duì)雪龍黑牛的活體采卵結(jié)果表明，每周采卵1次，第1次卵母細(xì)胞回收率70%，第2次采卵回收率44%。這可能是第1次穿刺卵母細(xì)胞中等卵泡數(shù)量比第2、3、4、5次多，便于穿刺。另外，隨著穿刺次數(shù)增加，卵母細(xì)胞募集速度變慢，所以可視卵泡數(shù)量減少。加上穿刺次數(shù)增加，卵巢受損增加，導(dǎo)致卵泡數(shù)量減少，從而回收率下降。

表1 采卵批次對(duì)活體采卵卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響

表2 不同品種連續(xù)活體采卵對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響

3.2 連續(xù)活體采卵對(duì)優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞回收率的影響 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，第1次活體采卵的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率最差，第2次不斷增加，第3、4、5次保持相對(duì)穩(wěn)定。這可能與各批次之間C級(jí)卵母細(xì)胞變化相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中隨著活體采卵次數(shù)增加，C級(jí)卵母細(xì)胞（裸卵和網(wǎng)狀細(xì)胞）所占的比例不斷減少。本研究平均優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（A+B級(jí)）的百分率為66.05%，與梁賢威等[16]報(bào)道優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞回收率為70.92%相似，與Yadav等[19]報(bào)道的經(jīng)馬絨毛膜促性腺激素（eCG）處理的摩拉母水?；铙w采卵回收率（71.60%）以及未經(jīng)處理的摩拉水牛卵母細(xì)胞平均回收率（64.18%）結(jié)果相似。比Di Francesco等[20]報(bào)道對(duì)意大利地中海水牛開(kāi)展活體采卵效果好，其優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率在52.7%～65.6%。本研究的結(jié)果表明，第1次活體采卵優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率低的原因，可能是由于第1次比其他各次的閉鎖卵泡較多，加上水牛卵母細(xì)胞透明帶脆弱和顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的連接不緊密相關(guān)，這與Le Van Ty等[21]報(bào)道卵泡閉鎖水平較高的觀點(diǎn)一致。隨采卵次數(shù)增加，閉鎖卵泡減少，C和D級(jí)卵母細(xì)胞所占比例減少，卵母細(xì)胞質(zhì)量提高，因而回收的可用卵母細(xì)胞比例也隨之增加。

3.3 不同品種水牛連續(xù)活體采卵對(duì)采卵效果的影響 本實(shí)驗(yàn)表明，尼里-拉菲水牛連續(xù)5次采卵，各批次卵母細(xì)胞回收率差異不顯著，但優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率差異顯著，第1次與第2、3次和5次相比回收效果最差；對(duì)卵母細(xì)胞回收率而言，摩拉水牛第1次回收效果最好，達(dá)63.06%，而其余各次回收率分別是46.32%、35.69%、47.01%、45.54%；優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率在48.43%～79.76%，第1次與其余各次間差異顯著；但雜交水?；厥章涯讣?xì)胞率、優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞回收率差異不顯著。與梁賢威等[16]報(bào)道的尼里拉菲、摩拉水牛卵母細(xì)胞回收率（67.41%、70.02%）相比差異較大。但比阿根廷的摩拉水牛活體采卵[23]效果好，其連續(xù)對(duì)摩拉水牛活體采卵6次，每次間隔7 d和14 d，平均每次卵母細(xì)胞回收率分別是31.5%、51%。優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞回收率與富鐘水牛[17]也有差異（激素處理組回收率為70.88%，未處理組為60.2%）。但與Neglia等[23]報(bào)道連續(xù)18次（每周采卵2次）活采非泌乳的地中海水牛優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（A+B級(jí)）平均回收率58.5% 相接近。Gimenes等[24]報(bào)道，用同期發(fā)情方法處理3個(gè)品種青年牛的第5、7、9天后進(jìn)行活體采卵，結(jié)果表明巴西的瘤牛、荷斯坦牛和水牛卵母細(xì)胞回收率分別是82.3%、66.7%、72.5%，優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞回收率分別是68.8%、57.7%、60.9%，瘤牛活體采卵效果比水牛和荷斯坦牛效果好，這是由于瘤牛的可視卵泡數(shù)比奶牛和水牛的多?？偠灾煌贩N之間，水?；铙w采卵效果不一致。

4 結(jié)論

隨著連續(xù)活體采卵次數(shù)增加，對(duì)水牛卵母細(xì)胞回收率有影響，而且可使水牛卵母細(xì)胞質(zhì)量得到提高，優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞數(shù)量增加；不同品種水牛連續(xù)活體采卵，優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞百分率和卵母細(xì)胞回收率不同。