李毓華， 謝建亮， 楊春蓮， 王 虹， 李偉弘， 楊 波， 王小平， 黃瑞萍， 雷初朝, 張國(guó)坪*

(1.固原市畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏 固原 756000；2.涇源縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏 涇源 756400;3.固原市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 固原 756000；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

肉牛胚胎移植是指將早期的胚胎通過(guò)一定的器械，移植到生理狀態(tài)相同的受體母牛子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，著床懷孕，達(dá)到正常妊娠，足月分娩，產(chǎn)出新生兒的全過(guò)程。2017年9月至2018年10月，在固原市的涇源縣上金村部分養(yǎng)牛戶和六盤(pán)山牧業(yè)有限責(zé)任公司，原州區(qū)的富民牛場(chǎng)和偉偉牛場(chǎng)，選擇西門塔爾牛、黑安格斯牛和秦川牛作為受體母牛，購(gòu)進(jìn)寧夏美佳農(nóng)生物科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)的引進(jìn)澳大利亞黑安格斯肉母牛生產(chǎn)的胚胎100枚，進(jìn)行胚胎移植試驗(yàn)，研究黑安格斯肉牛胚胎在固原市的移植受孕效果，為固原市肉牛的胚胎移植工作奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供體：從寧夏美佳農(nóng)生物科技發(fā)展股份有限公司購(gòu)買引自澳大利亞黑安格斯母牛生產(chǎn)的冷凍胚胎100枚；受體母牛來(lái)源：上金村養(yǎng)牛戶和六盤(pán)山牧業(yè)公司飼養(yǎng)的西門塔爾空懷母牛，富民牛場(chǎng)飼養(yǎng)的黑安格斯空懷母牛，偉偉牛場(chǎng)飼養(yǎng)的秦川?？諔涯概?。

1.2 方 法

利用非手術(shù)移植方法，在受體母牛發(fā)情后第7天，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的直腸檢查，通過(guò)觸摸受體母牛卵巢上黃體的發(fā)育情況，決定是否進(jìn)行移植。如果卵巢上的黃體發(fā)育比較好，確定黃體達(dá)到A級(jí)和B級(jí)以上方可進(jìn)行移植。移植后2個(gè)月內(nèi)，注意觀察已移植的受體母牛是否發(fā)情，若不發(fā)情，1個(gè)月應(yīng)用B超儀檢查是否懷孕；或者到2～3個(gè)月之間，通過(guò)直腸妊娠檢查確定是否懷孕。懷孕后的受體母牛注意做好安胎與保胎工作。

1.3 受體母牛的基本條件

采取全舍飼人工飼喂的飼養(yǎng)方式以及規(guī)模化牧場(chǎng)TMR機(jī)械化飼養(yǎng)受體母牛；選擇不同胎次的空懷母牛作受體；受體母牛健康狀況良好，生殖狀況良好，沒(méi)有布病、結(jié)核等傳染病，無(wú)寄生蟲(chóng)病和肢蹄病，也沒(méi)有生殖道疾病，具有正常的發(fā)情周期，經(jīng)產(chǎn)母牛產(chǎn)犢后時(shí)間為60～100 d為宜；受體母牛體況中等，營(yíng)養(yǎng)狀況中等，不過(guò)肥或過(guò)瘦，處于能量正平衡期。

1.4 藥品和器械

所需藥品：氯前列烯醇鈉(PG)、鹽酸利多卡因注射液、75%酒精、黃體酮注射液。

所需器械：法國(guó)IMV卡蘇式胚胎移植槍(適用于直徑3 mm外套，帶藍(lán)環(huán))、法國(guó)IMV直徑3 mm的輸胚槍無(wú)菌硬外套、IMV輸胚移植軟外套、一次性長(zhǎng)臂手套、乳膠手套、恒溫水浴鍋、烘箱、體視顯微鏡、B超妊娠診斷儀、5 mL一次性塑料注射器、液氮罐、保溫杯、長(zhǎng)臂鑷子、溫度計(jì)、止血鉗、細(xì)管剪。

2 結(jié)果與分析

分別在涇源縣上金村和六盤(pán)山牧業(yè)公司選擇西門塔爾空懷母牛作為受體母牛；在原州區(qū)頭營(yíng)鎮(zhèn)富民牛場(chǎng)選擇安格斯空懷母牛和偉偉牛場(chǎng)的秦川育成空懷母牛作為受體母牛，進(jìn)行黑安格斯牛胚胎移植，移植結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，100頭黑安格斯牛供體胚胎，分別移植給不同品種的100頭受體母牛，妊娠率為37.88%～65.00%，平均為45.00%，產(chǎn)犢率為31.82%～65.00%，平均為41.00%，流產(chǎn)率平均為8.89%。

表1 固原市黑安格斯牛胚胎移植效果

3 討 論

肉牛、奶牛的胚胎移植技術(shù)，目前技術(shù)非常成熟，已經(jīng)成了一門常規(guī)操作技術(shù)。肉牛胚胎移植成功率主要看妊娠率這個(gè)指標(biāo)。我國(guó)已經(jīng)報(bào)道的100頭以上肉牛胚胎移植的成功率在50%左右[1-2]。焦仁剛等[1]在貴州省納雍縣、開(kāi)陽(yáng)縣、印江縣和青酒集團(tuán)等地開(kāi)展安格斯肉牛冷凍胚胎移植工作，通過(guò)對(duì)268頭受體母牛進(jìn)行冷凍胚胎移植,60 d后妊娠檢查,妊娠率達(dá)50.75%，比本研究的安格斯牛胚胎移植妊娠率高5.75%。張春等[2]在甘肅省武威市、平?jīng)鍪小⒊缧趴h、靈臺(tái)縣開(kāi)展了6個(gè)進(jìn)口肉牛品種的冷凍胚胎移植工作，對(duì)于黃體合格的253頭受體母牛進(jìn)行了進(jìn)口肉牛冷凍胚胎移植,移植妊娠率為50.9%，比本研究的移植妊娠率高5.9%。程華等[3]在貴州省納雍縣開(kāi)展了安格斯牛冷凍胚胎移植工作,經(jīng)過(guò)對(duì)黃體合格的122頭受體母牛進(jìn)行安格斯牛冷凍胚胎移植，移植妊娠率為49.5%，比本研究的移植妊娠率高4.5%。張俊功等[4]從加拿大引進(jìn)良種肉牛利木贊、西門塔爾、蓋洛威凍胚，移植受體429頭次，經(jīng)產(chǎn)黃牛移植成功率為49.2%，比本研究的移植妊娠率高4.2%。宣小龍等[5]選用受體黃牛490頭，他們發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉、維生素、HCG能明顯提高受體黃牛胚胎移植的受胎率，其受胎率分別為57.1%，58.3%和59.2%，與對(duì)照組受胎率為48.3%相比，差異顯著(P<0.05)，該研究對(duì)照組受胎率比本研究的移植妊娠率高3.3%。宣小龍等[5]把受體牛的子宮黃體生理狀況分A級(jí)與B級(jí)，其移植受胎率分別達(dá)到55.8%和45.9%；張俊功等[4]對(duì)A級(jí)黃體受體牛移植成功率為54.7%，B級(jí)黃體受體牛移植成功率為44.7%。比較表明，本研究的受體牛移植成功率為45.0%，相當(dāng)于B級(jí)黃體受體牛移植成功率水平，因此，我們還需要提高黃牛冷凍胚胎移植水平，再提高5%，才達(dá)到國(guó)內(nèi)平均水平。

因此，通過(guò)在寧夏固原市涇源縣和原州區(qū)選用不同品種母牛作為受體母牛，移植從澳大利亞引進(jìn)的黑安格斯供體母牛生產(chǎn)的冷凍胚胎，通過(guò)胚胎移植技術(shù)可以快速達(dá)到引種的目的，且簡(jiǎn)便快捷高效。本研究認(rèn)為，要提高肉牛胚胎移植水平，需要注意如下幾點(diǎn)：

(1)選擇適宜的母牛作為受體母牛。要求受體母牛健康，無(wú)其他疾病，特別是沒(méi)有生殖系統(tǒng)疾病。對(duì)于偏肥或偏瘦的；卵巢發(fā)育不全或靜止的；發(fā)情周期紊亂、排卵不正常的；以及人工授精3次以上未能受孕的母牛，都不適宜作為受體母牛選用。盡量選擇體格較大，性情溫順的當(dāng)?shù)啬概?，年齡以2～6歲為佳。初次育成牛必須達(dá)到成年牛體重的75%為宜。

(2)加強(qiáng)受體母牛飼養(yǎng)管理，提高受體母牛的營(yíng)養(yǎng)水平，為其提供營(yíng)養(yǎng)全價(jià)的配合日糧，促進(jìn)受體母牛正常的繁殖機(jī)能，提高胚胎移植受孕率。在正常的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，給受體母牛多增加0.5～1.0 kg精飼料外，在精飼料中還要加入維生素和微量元素添加劑，每頭母牛每天盡量保證采食紫花苜蓿干草1.0 kg。

(3)準(zhǔn)確把握發(fā)情時(shí)間，做到適時(shí)移植。受體母牛發(fā)情后，一定要根據(jù)其發(fā)情時(shí)間和發(fā)情狀態(tài)確定合適的時(shí)間及時(shí)進(jìn)行胚胎移植工作，盡量使母牛子宮狀態(tài)與胚胎的胚齡相吻合，達(dá)到同步移植，才能獲得較高的胚胎移植受胎率。在實(shí)踐中，有些母牛不發(fā)情，多是由于卵巢上存在持久黃體，從而抑制了正常發(fā)情；母牛不發(fā)情，就不能正常排卵形成新生黃體，因而不能進(jìn)行胚胎移植。

(4)做好發(fā)情后受體母牛卵巢上的黃體檢查。在胚胎移植前，要對(duì)受體母牛進(jìn)行直腸檢查，確定受體母牛黃體發(fā)育情況。發(fā)育良好的黃體，突出于母牛卵巢表面，質(zhì)地柔軟，有彈性，根植于卵巢體積的1/3大小，有的突出于卵巢表面的黃體直徑達(dá)1 cm以上。底部充實(shí)，圓潤(rùn)平滑，富有彈性。這種黃體確定為A級(jí)黃體。但也有個(gè)別母牛卵巢扁小，所形成的黃體沒(méi)有達(dá)到要求那么大，但黃體的質(zhì)地彈性和柔軟程度都很好，這樣的黃體確定為B級(jí)黃體。B級(jí)黃體的受體母牛也可以進(jìn)行胚胎移植，也可以獲得較為理想的受胎率。在檢查受體母牛卵巢黃體時(shí)，要求檢查動(dòng)作輕柔，千萬(wàn)不可用力擠壓，以免損傷黃體，造成黃體脫落，影響胚胎著床，進(jìn)而影響胚胎移植受胎率。

(5)對(duì)于進(jìn)行移植的胚胎質(zhì)量一定要求嚴(yán)格。在實(shí)際生產(chǎn)中，要求移植的胚胎質(zhì)量必須達(dá)到B級(jí)以上；C級(jí)胚胎不能單獨(dú)移植，可與A級(jí)或B級(jí)胚胎搭配進(jìn)行移植；D級(jí)胚胎因質(zhì)量不能保證，而建議淘汰不要用于移植。胚胎存活質(zhì)量是決定胚胎移植后能否成功的重要因素之一，只有好的胚胎質(zhì)量才能獲得較高的胚胎移植受胎率。

(6)受體母牛在進(jìn)行移植時(shí)要求麻醉劑量要適當(dāng)。麻醉的目的，為了減輕移植時(shí)對(duì)受體母牛直腸的刺激，使其安穩(wěn)站立。防止直腸努責(zé)，便于移植操作。麻醉方式一般采用尾椎麻醉，如果麻醉部位靠前或靠后；或者麻醉劑量不足，則直腸努責(zé)得不到抑制，不利于實(shí)際操作；如果麻醉劑量過(guò)大，則使直腸括約肌過(guò)度松弛，在直腸內(nèi)形成大量管狀空腔，甚至有的后肢麻痹站立不起，給移植操作帶來(lái)不便。

(7)胚胎移植操作應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。胚胎一般是在供體母牛子宮內(nèi)發(fā)育7 d以后，經(jīng)過(guò)一定的技術(shù)手段采集出來(lái)，通過(guò)顯微鏡下仔細(xì)收集，精心鑒定，體外培養(yǎng)，優(yōu)質(zhì)A、B級(jí)胚胎才能冷凍保存。移植時(shí)，也要求在受體母牛發(fā)情后第7天，與胚胎日齡達(dá)到一致時(shí)，才能進(jìn)行胚胎移植工作。移植部位是受體母牛黃體發(fā)育良好的一側(cè)子宮角內(nèi)上1/2～1/3處。這就要求操作人員要在短時(shí)間內(nèi)將已解凍后的胚胎盡快移植到受體母牛子宮內(nèi)，移植持續(xù)時(shí)間越短越好。移植位置要求精準(zhǔn)，手法要求熟練，動(dòng)作要輕柔慢，操作力度要小，盡量防止損傷受體母牛子宮。同時(shí)，要注意兩手的協(xié)調(diào)和配合，熟練準(zhǔn)確地進(jìn)行胚胎移植，避免移植過(guò)程中擦傷子宮內(nèi)膜，引起子宮內(nèi)膜出血，造成感染，導(dǎo)致胚胎的早期死亡，進(jìn)而發(fā)生流產(chǎn)。

總之，提高胚胎移植成功率的關(guān)鍵是熟練掌握胚胎移植技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)，熟練掌握直腸檢查技術(shù)和輸胚技術(shù)，做到對(duì)黃體發(fā)育程度的精準(zhǔn)判斷，以及受體母牛子宮發(fā)育情況的準(zhǔn)確判定。