李永麗 王亞紅 周 洲 曲良建

(1. 河南科技大學(xué)林學(xué)院 洛陽(yáng) 471023； 2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與森林保護(hù)研究所, 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091)

新疆野蘋果(Malussieversii) 又名塞威氏蘋果，是我國(guó)重要的野生果樹(shù)資源，為現(xiàn)代栽培蘋果的原始祖先(閆鵬等， 2016)。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，新疆野蘋果擁有豐富的遺傳多樣性，具有抗旱、抗寒、抗病蟲和耐瘠薄等特點(diǎn)(馬闖等， 2018)，引起眾多研究者的關(guān)注。關(guān)于新疆野蘋果的研究多集中在種群、生態(tài)及遺傳特性方面(田潤(rùn)煒等， 2016； 陳學(xué)森等， 2006； 吳傳金等， 2008； 馮濤等， 2006)，種子萌發(fā)特性(閆秀娜等， 2015)、繁育特性(秦偉等， 2010)、環(huán)境抗逆(徐彥等， 2010； 于瑋瑋等， 2016)和種質(zhì)資源(秦偉等， 2011) 等，但有關(guān)新疆野蘋果內(nèi)生菌的研究鮮有報(bào)道。筆者課題組已對(duì)新疆野蘋果內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分離研究，已獲得對(duì)蘋果病原菌具較好生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌7株(李永麗等， 2020) 和內(nèi)生真菌5株(王亞紅等， 2020)。

鏈霉菌(Streptomyces) 可產(chǎn)生多種對(duì)植物病原菌有拮抗作用的次生代謝產(chǎn)物，內(nèi)生鏈霉菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中。從植物體內(nèi)分離的鏈霉菌具有很高的應(yīng)用價(jià)值，很多鏈霉菌已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用于植物病害生物防治(Coombsetal., 2003； 梁亞萍等， 2007； 涂璇等， 2008； 陳紅兵等， 2011； 王靖， 2011； 李慶蒙等， 2013； 沈玥， 2014； 張志斌等， 2015； 王相晶， 2015)。目前，新疆野蘋果內(nèi)生鏈霉菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，有待開(kāi)發(fā)其資源。筆者課題組從新疆野蘋果枝干中分離得到1株內(nèi)生鏈霉菌菌株A-m1，初步發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)烈的抑菌活性，活性超過(guò)之前分離的內(nèi)生細(xì)菌(李永麗等， 2020) 和內(nèi)生真菌(王亞紅等， 2020)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)菌株A-m1菌落培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和理化性質(zhì)研究，以期明確其分類地位，優(yōu)化其發(fā)酵條件，并探究對(duì)蘋果等病害病原物的抑菌活性和抑菌廣譜性，為相關(guān)病害的生物防治以及該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌： 葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、蘋果擬莖點(diǎn)霉(Phomopsismali)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、君子蘭莖基腐尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、南天竹炭疽菌(Colletotrichumkarstii) 均由河南科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

培養(yǎng)基： NA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基(方中達(dá)，1998)、PDB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組，1975)、ISP2培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基、ISP4培養(yǎng)基、ISP5培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基、柴斯納瓊脂(Tresner) 培養(yǎng)基、酪氨酸培養(yǎng)基、碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Bennett培養(yǎng)基、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基(李其利， 2011)。6種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，代號(hào)分別為 A、B、C、D、E和F。A： 高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基(戴蓬博等, 2016)； B： 葡萄糖 10 g、蛋白胨 3 g、NaCl 2.5 g、CaCO32 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4(閆建芳等， 2016)； C： 乳糖10 g、牛肉膏10 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.002 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.2～7.4(何紅， 2015)； D： 蔗糖 20 g、可溶性淀粉 30 g、蛋白胨 2 g、黃豆粉 8 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO33 g、K2HPO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.2～7.4(王辰等， 2015)； E： NA液體培養(yǎng)基； F： PDB培養(yǎng)基參照方中達(dá)(1998)配方。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鏈霉菌菌株A-m1的分離與鑒定 1) 菌株A-m1的分離與純化 將新疆野蘋果健康枝條韌皮部和木質(zhì)部分別剪成5 mm × 5 mm 左右的組織塊，75%的酒精消毒30 s，1% 次氯酸鈉消毒3 min，無(wú)菌水漂洗3次后，組織塊用稀釋分離法分離內(nèi)生菌(方中達(dá)，1998)，涂布高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)。取最后一次漂洗的無(wú)菌水做為對(duì)照涂布于培養(yǎng)基表面。觀察內(nèi)生菌生長(zhǎng)情況，適時(shí)挑取有放射狀菌絲的菌落劃線于PDA培養(yǎng)基上，純化3次后保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 菌株A-m1培養(yǎng)特征觀察 將菌株A-m1分別接種在 ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、PDA、NA、LB、PSA、高氏一號(hào)培養(yǎng)基上(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組，1975； 周德慶，1986)，28 ℃ 培養(yǎng) 10 天，觀察統(tǒng)計(jì)其培養(yǎng)特征。

3) 菌株A-m1形態(tài)特征觀察 在PDA培養(yǎng)基上劃線接種菌株A-m1，同時(shí)在接種位點(diǎn)將滅菌的蓋玻片(18 mm×18 mm)斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，在菌物培養(yǎng)箱中28 ℃ 培養(yǎng)4～7 天取出插片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其氣生菌絲、孢子鏈和孢子的形態(tài)特征。

4) 菌株A-m1生理生化特征分析 參照文獻(xiàn)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組，1975； 周德慶，1986)試驗(yàn)方法測(cè)定一系列生理生化特性，包括碳源利用、纖維素水解、產(chǎn)H2S、產(chǎn)黑色素、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、明膠液化、耐鹽性(1%、3%、5%、7%)，生長(zhǎng)溫度范圍(16、22、28、34、40 ℃)。

“教學(xué)”主要反映教師的教學(xué)水平、教學(xué)創(chuàng)新能力，以及教學(xué)成果的社會(huì)影響。有關(guān)評(píng)價(jià)要素包括：在各級(jí)教學(xué)成果評(píng)比、教學(xué)大賽中獲得的成績(jī)，教改課題，教學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)（大數(shù)據(jù)反映的教師所任教班級(jí)學(xué)科成績(jī)的變化、教師教學(xué)情況等）；各級(jí)示范課、展示課等。其中，“教改課題”的認(rèn)可度為中上等（事后訪談得知，有不少調(diào)查對(duì)象將該項(xiàng)列入了科研類），其他各評(píng)價(jià)要素的認(rèn)可度都為高。

5) 菌株A-m1 16S rDNA序列測(cè)定 提取菌株A-m1基因組DNA，對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物為16SL(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACCT-3′)和16SR(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性3 min； 98 ℃ 變性10 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸7 min。將擴(kuò)增出的目的片段測(cè)序[生工生物工程(上海)股份有限公司]，測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast相似性比對(duì)，下載同源性高的相關(guān)菌株序列，使用 Clustal X2進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA 4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 菌株A-m1發(fā)酵條件優(yōu)化 1) 發(fā)酵最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 將菌株A-m1接種于NA液體培養(yǎng)基，在28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)至OD值1.0時(shí)做為種子液。然后取1 mL種子液分別接入裝有20 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶(50 mL)中，28 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)4 天，發(fā)酵液10 000 r·min-1離心10 min； 上清液在超凈工作臺(tái)中使用無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾器(孔徑0.22 μm) 過(guò)濾，取5 mL過(guò)濾液加入到 75 mL的PDA培養(yǎng)基中，倒制3個(gè)平板，以葡萄座腔菌為指示菌做平板對(duì)峙試驗(yàn)，菌絲生長(zhǎng)速率法計(jì)算抑菌率。抑菌率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100。

2) 發(fā)酵液高抑菌活性最佳碳源篩選 改變高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中碳源成分，其他物質(zhì)不變。碳源含量分別為2% 的可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、木糖、果糖、阿拉伯糖和不加碳源。不同碳源培養(yǎng)基中分別加入5% 菌株A-m1種子液，發(fā)酵條件及后續(xù)抑菌率試驗(yàn)方法同上。

3) 發(fā)酵液高抑菌活性最佳氮源篩選 改變高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中氮源成分，其他物質(zhì)不變。氮源含量分別為l% 的硝酸鉀、氯化銨、酵母膏、蛋白胨、黃豆粉和不加氮源，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。不同氮源培養(yǎng)基中分別加入5% 鏈霉菌A-m1種子液，發(fā)酵條件及后續(xù)抑菌率試驗(yàn)方法同上。

4) 發(fā)酵條件優(yōu)化 采用單因素變量法，評(píng)價(jià)各發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌的抑菌率，抑菌試驗(yàn)同1.2.2中1)，確定最佳發(fā)酵條件。最適接種量： 設(shè)置接種量參數(shù)為 2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%，在 28 ℃、180 r·min-1發(fā)酵條件下培養(yǎng) 4天。最適培養(yǎng)時(shí)間： 在最適接種量基礎(chǔ)上，發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為2、4、6、8、10 天，在28 ℃、180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)。最適發(fā)酵溫度： 在最適接種量和最適發(fā)酵時(shí)間條件下，設(shè)置溫度 20、23、26、29、32 ℃ 培養(yǎng)。在最適接種量、發(fā)酵時(shí)間及溫度基礎(chǔ)上，設(shè)置初始培養(yǎng)基 pH值 3、4、5、6、7、8、9、10、11和12進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。在最適接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和 pH 值基礎(chǔ)上，于500 mL三角瓶中分別裝入 50、100、150、200、250 mL液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)酵濾液抑菌譜的測(cè)定 在前述最佳碳源、氮源和發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，獲得無(wú)菌發(fā)酵濾液，配制平板方法同，測(cè)定對(duì)葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌、蘋果擬莖點(diǎn)霉、小麥紋枯病菌、小麥全蝕病菌、番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、君子蘭莖基腐尖孢鐮刀菌和南天竹炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。同時(shí)設(shè)置1 g·L-1的70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑(濟(jì)南農(nóng)化有限公司) 和80% 多菌靈可濕性粉劑(一帆生物科技有限公司) 試驗(yàn)組，與A-m1發(fā)酵濾液抑菌效果對(duì)比。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Oneway ANOVA方差分析，顯著性水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A-m1的分離與鑒定

2.1.1 菌株A-m1培養(yǎng)特征 培養(yǎng)特征統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1，典型特征見(jiàn)圖1。菌株A-m1在不同培養(yǎng)基上氣生菌絲初期均為白色，后期生長(zhǎng)出孢子堆，菌落顏色多呈現(xiàn)棕色和紫色，基內(nèi)菌絲多表現(xiàn)出黃色，在多種培養(yǎng)基中可產(chǎn)黃色可溶性色素。

表1 菌株A-m1在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of strain A-m1 on different media

圖1 菌株A-m1在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)10天的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain A-m1 on different media for 10 daysa.ISP2培養(yǎng)基； b.ISP3培養(yǎng)基; c.ISP4培養(yǎng)基； d.ISP5培養(yǎng)基； e.LB培養(yǎng)基； f.NA培養(yǎng)基； g.PDA培養(yǎng)基； h.PSA培養(yǎng)基； i.高氏一號(hào)培養(yǎng)基。a.ISP2 medium; b.ISP3 medium; c.ISP4 medium; d.ISP5 medium; e.LB medium; f.NA medium； g.PDA medium; h.PSA medium; i.Gause I medium.

2.1.2 菌株A-m1形態(tài)特征 菌株 A-m1 在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 6 天后，單菌落圓形，直徑1～1.5 cm，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)生密集孢子堆，菌落棕色，產(chǎn)黃色可溶性色素。菌絲分枝較多，無(wú)橫隔膜，孢子鏈形成初期 2～6 圈螺旋，后期孢子鏈伸展，孢子長(zhǎng)圓形，表面光滑，見(jiàn)圖 2。

圖2 鏈霉菌菌株A-m1菌落、氣生菌絲及孢子鏈形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of colony, aerial mycelium and spore chains of Streptomyces A-m1a. 菌落； b. 氣生菌絲； c、d. 孢子鏈。a. Colony; b. Aerial mycelium; c、d. Spore chain.

2.1.3 菌株A-m1生理生化特征統(tǒng)計(jì) 菌株 A-m1 生理生化相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表 3。生理生化特征是鏈霉菌近分類鑒別的主要依據(jù)，A-m1 與其親緣特別相近的 3 個(gè)種模式菌株進(jìn)行了比較，包含婁徹氏鏈霉菌S.rocheiD164(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組，1975； 信艷娟等， 2012)、哥斯達(dá)黎加鏈霉菌(S.costaricanus)(Esnardetal.， 1995; Guetal.， 2012)、鼠灰鏈霉菌(S.murinus)(Shamsetal.， 2010; Cuietal.， 2012)。菌株 A-m1 能利用木糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、水楊苷作為碳源； 其中對(duì)棉籽糖、甘露醇和水楊苷利用能力較弱，不能利用肌醇和蔗糖。菌株能使牛奶凝固與胨化，30 天后不能使明膠液化，能使纖維素分解和淀粉水解，不產(chǎn)生硫化氫和黑色素。耐鹽性結(jié)果顯示，鏈霉菌 A-m1 在 NaCl 含量 1%～7% 的培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)，7% 條件下生長(zhǎng)情況變差。從菌株生長(zhǎng)溫度測(cè)定結(jié)果顯示，16～40 ℃ 菌株均能生長(zhǎng)，22～28 ℃ 條件下生長(zhǎng)情況良好，34 ℃ 以上溫度菌株生長(zhǎng)情況變差。生理生化指標(biāo)測(cè)定表明菌株A-m1屬于婁徹氏鏈霉菌。

表3 菌株A-m1與近緣種之間生理生化特征對(duì)比①Tab.3 Comparison of physiological and biochemical characteristics between strain A-m1 and relative species

2.1.4 16S rDNA基因序列進(jìn)化分析 菌株 A-m1 的 16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得 1 390 bp 的序列，同源進(jìn)化分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3，菌株A-m1(16S rDNA收錄號(hào)： MK990649.1) 與婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)(16S rDNA收錄號(hào)： AP018517.1)、鼠灰鏈霉菌(S.murinus)(16S rDNA收錄號(hào)： NR 112445) 和哥斯達(dá)黎加鏈霉菌(S.costaricanus)(16S rDNA收錄號(hào)： NR 041414) 聚在同一分支上，相似性 100%。結(jié)合對(duì)菌株A-m1的形態(tài)觀察和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，菌株 A-m1鑒定屬于婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)，命名為StreptomycesrocheiA-m1。

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 16S rDNA sequence of strain A-m1 in the phylogenetic tree

2.2 菌株A-m1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定 統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌的抑菌作用，如圖4。A、B、C、D、E、F培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌率分別為95.05%±1.80%、88.28%±4.75%、3.39%±2.51%、98.18%±0.90%、5.06%±2.74%、2.28%±1.16%。A、B、D 3種培養(yǎng)基獲得的發(fā)酵濾液抑菌率較高，其中A和D培養(yǎng)基的抑菌率最高，處于同一水平，顯著高于另外4種供試培養(yǎng)基。C、E和F 3種培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性非常低，它們的發(fā)酵液基本沒(méi)有色素，并且氣味小，發(fā)酵液離心發(fā)現(xiàn)其中菌體含量卻較多，說(shuō)明這3種培養(yǎng)基非常有利于菌株A-m1的增殖，但次生產(chǎn)物代謝合成不旺盛。由于A培養(yǎng)基成本更低，且配制操作更簡(jiǎn)易，因此確定高氏一號(hào)培養(yǎng)基為菌株A-m1高抑菌活性最適發(fā)酵基本培養(yǎng)基。

圖4 菌株 A-m1不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of strain A-m1 from different media fermentation broth against B. dothidea

2.2.2 最適碳源和氮源的確定 不同碳源培養(yǎng)基菌株A-m1發(fā)酵濾液所表現(xiàn)的抑菌活性，如圖5A。抑菌率大小排序： 可溶性淀粉 > 阿拉伯糖 > 麥芽糖 > 葡萄糖 > 果糖 > 不加碳源 > 木糖。可溶性淀粉作為唯一碳源時(shí)，菌株A-m1對(duì)葡萄座腔菌抑菌率為93.69%±1.52%，抑菌活性顯著高于其他碳源。因此，可溶性淀粉做為菌株A-m1發(fā)酵最適碳源。

不同氮源培養(yǎng)基菌株A-m1發(fā)酵濾液所表現(xiàn)的抑菌活性，如圖5B。抑菌率大小排序： 硝酸鉀 > 酵母膏 > 黃豆粉 > 蛋白胨 > 不加氮源 > 氯化銨。硝酸鉀和酵母膏作為氮源時(shí)，發(fā)酵濾液的抑菌活性處于同一水平，抑菌率分別為93.69%±1.52%和93.45%±2.63%，顯著高于與其他氮源成分發(fā)酵率液的抑菌活性。由于硝酸鉀成本更低，確定硝酸鉀做為菌株A-m1發(fā)酵最適氮源。

圖5 不同碳源、氮源條件下菌株A-m1發(fā)酵濾液抑菌活性Fig.5 The inhibition effect of different carbon and nitrogen sources on fermentation broth of strain A-m1

2.2.3 菌株A-m1發(fā)酵條件的優(yōu)化 接種量在2%～20% 范圍內(nèi)增加，發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌的抑菌率的趨勢(shì)(圖6A)呈先增加、趨于平穩(wěn)、后下降。抑菌率分別為45.77%±2.55%、92.59%±2.42%、91.27%±2.10%、93.39%±1.21%、92.86%±0.79%、85.71%±3.64%、85.71%±2.75%。 4%、6%、8%、10% 的接種量抑菌率差異不顯著，抑菌率處于最高水平； 從使用種子液量少考慮，4% 為最佳接種量。

4%接種種子液，培養(yǎng)2～20 天發(fā)酵濾液產(chǎn)生的抑菌作用先增加后降低(圖6B)，抑菌率分別為69.83%±2.56%、92.96%±1.86%、95.66%±1.05%、91.48%±1.84%、90.00%±1.84%、85.44%±1.46%、87.62%±0.73%。4天和6天的抑菌活性最強(qiáng)，兩者之間處于同一水平，但顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間； 從節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間考慮，4 天為最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

4%接種量分別在 20～32 ℃ 條件發(fā)酵培養(yǎng) 4 天，統(tǒng)計(jì)發(fā)酵濾液抑菌率(圖6C)。各溫度條件下發(fā)酵濾液抑菌活性都很強(qiáng)，其中 23、26、29、32 ℃ 培養(yǎng)溫度對(duì)應(yīng)抑菌率最高，處于同一水平； 從節(jié)約能源考慮，可以從 23～32 ℃ 溫度區(qū)間選擇接近環(huán)境的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)基初始pH3～12范圍，按 4% 接種量、23 ℃、培養(yǎng)4 天發(fā)酵濾液的抑菌率先增加后降低(圖6D)。pH6、pH7、pH8時(shí)處于同一顯著水平，抑菌率最高； A-m1發(fā)酵起始最適pH6～8之間均可。

培養(yǎng)基 pH7， 4% 接種量，23 ℃ 培養(yǎng)4 天，容量為500 mL 的三角瓶裝液50～250 mL對(duì)應(yīng)抑菌率先增加后減小(圖6E)。50 mL和100 mL裝液量得到的抑菌率最高，兩者處同一水平； 從單位容器產(chǎn)量高考慮，100 mL/500 mL作為最佳裝液量。

菌株A-m1較合適的發(fā)酵條件綜上應(yīng)設(shè)置為 4% 接種量，裝液量100 mL/500 mL、pH值6～8之間、發(fā)酵溫度 23～32 ℃ 和發(fā)酵培養(yǎng)4天。

2.3 菌株A-m1發(fā)酵濾液抑菌廣譜性

PDA培養(yǎng)基中加入5 mL最適培養(yǎng)條件下獲得的菌株A-m1發(fā)酵濾液，對(duì)3種蘋果枝干病原菌和6種其他植物病原菌均表現(xiàn)出抑菌作用(圖7)，說(shuō)明菌株A-m1具抑菌廣譜性。發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌的抑菌率為95.21%±0.00%，對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌率為83.08%±1.38%，對(duì)蘋果擬莖點(diǎn)霉的抑菌率為91.04%±1.55%，對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌率為77.60%±3.67%，對(duì)南天竹炭疽菌的抑菌率為66.88%±1.10%，對(duì)君子蘭莖基腐尖孢鐮刀菌的抑菌率為64.03%±0.82%，對(duì)小麥赤霉病菌的抑菌率為82.03%±2.28%，對(duì)小麥紋枯病菌的抑菌率為80.89%±0.96%，對(duì)小麥全蝕病菌的抑菌率為31.27%±2.13%。對(duì)葡萄座腔菌、蘋果擬莖點(diǎn)霉的抑菌作用強(qiáng)，抑菌率在90% 以上； 對(duì)小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌的抑菌率超過(guò)80%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果。與甲基硫菌靈和多菌靈抑菌作用相比(表2)，5 mL的菌株A-m1發(fā)酵濾液對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用高于1 g·L-1濃度70% 甲基硫菌靈，對(duì)番茄灰霉病菌、小麥紋枯病菌的防抑制作用高于1 g·L-1濃度80% 多菌靈。

圖6 不同發(fā)酵條件菌株 A-m1發(fā)酵濾液抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of strain A-m1 under different fermentation conditions

圖7 菌株 A-m1 發(fā)酵濾液對(duì) 9 種植物病原菌平板對(duì)峙Fig.7 The antagonism of the strain A-m1 fermentation broth to 9 plant diseasesA.葡萄座腔菌B. dothidea； B.膠孢炭疽菌C. gloeosporioides； C.蘋果擬莖點(diǎn)霉P. mali； D.番茄灰霉病菌 B. cinerea； E.南天竹炭疽病菌C. karstii； F.君子蘭莖基腐病菌F. oxysporum； G.小麥赤霉病菌F. graminearum； H.小麥紋枯病菌R. cerealis； I.小麥全蝕病菌 G. graminis. 每幅圖左培養(yǎng)皿為空白平板對(duì)照，有培養(yǎng)皿為添加有發(fā)酵濾液平板。 Each petri dish on the left is a blank plate control, and the right petri dish is a plate with a fermentation filtrate added.

表2 菌株A-m1發(fā)酵濾液和2種農(nóng)藥對(duì)9種植物病原菌抑制作用Tab.2 Inhibition effect of strain A-m1 fermentation broth and two pesticides on 9 plant diseases

3 討論

關(guān)于婁徹氏鏈霉菌在植物病害生防上已有一些研究，如：菌株Lj20是從山西臨汾辣椒根部分離的內(nèi)生菌 (馬林等，2008)，其抗真菌代謝產(chǎn)物是2，6-二叔丁基對(duì)甲酚和3，5-二叔丁基-4-羥基-苯甲醚；婁徹氏鏈霉菌ACTA1551(Kaninietal., 2013)是分離自希臘的一株內(nèi)生菌，可防治尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的番茄枯萎病，同時(shí)還能促進(jìn)植株的生長(zhǎng)；菌株TRM42561從新疆鹽環(huán)境中分離得到 (柳成賓等，2014)，室內(nèi)對(duì)棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)菌絲生長(zhǎng)抑制率為 83.75%，孢子萌發(fā)抑制率為 68.75%，田間防治效果達(dá)到 41.65%；婁徹氏鏈霉菌菌株ZZ-9出甘肅隴東蘋果根際土壤中分離得到 (薛應(yīng)鈺等，2016)，對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病菌Cytosporasp.生長(zhǎng)抑制率可達(dá)96%。 但以上研究中并未提及發(fā)酵液產(chǎn)生色素的現(xiàn)象，本研究中分離得到的婁徹氏鏈霉菌 A-m1在抑菌作用高的時(shí)候，發(fā)酵液呈現(xiàn)出黃色。A-m1發(fā)酵液高抑菌活性與其色素產(chǎn)生同步的現(xiàn)象是本研究初次報(bào)道，該現(xiàn)象可能是菌株A-m1特有性狀。菌株A-m1在多種固體培養(yǎng)基中也有色素產(chǎn)生，但不能使明膠液化，這與菌株Lj20(馬林等， 2008)特征存在區(qū)別。這也說(shuō)明不同地理?xiàng)l件下的婁徹氏鏈霉菌由于其生態(tài)適應(yīng)性存在一定差別，其他未知的生物功能差別有待進(jìn)一步研究。

葡萄座腔菌寄主范圍廣泛，除蘋果外，還可危害楊樹(shù)(Populus)等十多種樹(shù)木(楊蕾等， 2015)。由葡萄座腔菌引起的蘋果輪紋病，不僅造成枝干枯死，嚴(yán)重削弱樹(shù)勢(shì)，甚至可導(dǎo)致?tīng)€果，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，在我國(guó)各蘋果產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，且近年來(lái)病情逐漸加重； 同時(shí)擬莖點(diǎn)霉菌和膠孢炭疽菌也危害蘋果等果樹(shù)的枝條和主干，造成枯枝和枯干，嚴(yán)重時(shí)甚至整株死亡(胡玉清等， 2016)。目前化學(xué)防治是蘋果枝干病害最主要的方法，化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，易造成環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留超標(biāo)，威脅人類健康，甚至導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性(李曉軍等， 2009； 楊煒華等， 2002)。本試驗(yàn)中菌株A-m1發(fā)酵濾液5 mL對(duì)葡萄座腔菌抑菌率超過(guò)95%，超過(guò)1 g·L-1的多菌靈產(chǎn)生的作用效果，A-m1發(fā)酵濾液對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌率為83.08%±1.38%，對(duì)蘋果擬莖點(diǎn)霉的抑菌率為91.04%±1.55%，對(duì)3種蘋果枝干病原均表現(xiàn)出良好的抑菌活性。薛應(yīng)鈺等(2016) 報(bào)道了婁徹氏鏈霉菌菌株ZZ-9對(duì)殼囊孢Cytosporasp.的抑制作用，但引起蘋果樹(shù)腐爛病菌的病原種類有多種，ZZ-9對(duì)本研究中選擇的3種蘋果枝干病害病原的活性尚不明確。筆者還采用了接種試驗(yàn)評(píng)價(jià)菌株A-m1的致病性，結(jié)果表明其對(duì)蘋果枝干不具有致病性(李永麗等， 2020)，該菌株來(lái)源于新疆野蘋果內(nèi)生菌，理論上也能生存于蘋果樹(shù)體內(nèi)，將A-m1用于蘋果樹(shù)病害生防是否長(zhǎng)期發(fā)揮防效有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在對(duì)3種蘋果枝干病原表現(xiàn)出抑菌活性之外，本研究還選擇了園林植物、蔬菜、和糧食作物上的幾種病原開(kāi)展了抑菌試驗(yàn)。番茄灰霉病是蔬菜重要病害，多年來(lái)一直依賴化學(xué)藥劑防治，對(duì)多種農(nóng)藥都產(chǎn)生了抗藥性(紀(jì)明山等， 2003)。對(duì)番茄灰霉病菌的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中，A-m1發(fā)酵濾液抑菌作用高于甲基硫菌靈和多菌靈。A-m1發(fā)酵濾液對(duì)參試的園林植物、蔬菜、和糧食作物的部分病原均表現(xiàn)出抑菌作用，菌株 A-m1抑菌具有廣譜性，抑菌活性明顯，具有對(duì)多種植物病害進(jìn)行生物防治的應(yīng)用潛力。

鏈霉菌防治植物病害的作用機(jī)制主要有3種： 抗生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用和寄生作用，其中最主要的是抗生作用。在本研究中用到了A-m1發(fā)酵濾液，對(duì)多種病原表現(xiàn)出抑菌活性，說(shuō)明A-m1產(chǎn)生了抗生物質(zhì)； 但其抗生物質(zhì)是否是一種或多種物質(zhì)，其含量也不清楚，有必要對(duì)抑菌物質(zhì)開(kāi)展萃取和分離進(jìn)一步研究，有可能為開(kāi)發(fā)新型抑菌化合物提供參考。Abbasi等(2019) 用婁徹氏鏈霉菌Y28菌株處理番茄后能誘導(dǎo)植物中過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶活性的增加，從而誘導(dǎo)出對(duì)鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)3菌株特異性的系統(tǒng)抗性。本研究使用的A-m1菌株是否能引起相關(guān)植物的系統(tǒng)抗病性，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

本研究從新疆野蘋果枝干中分離得到1株內(nèi)生具生防作用的婁徹氏鏈霉菌S.rocheiA-m1，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)為CCTCC M 2019266。高抑菌發(fā)酵條件最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高氏一號(hào)，最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為硝酸鉀； 發(fā)酵起始種子液接種量4%，在23～32 ℃、pH6～8之間、裝液量100/500 mL和發(fā)酵培養(yǎng) 4 天為較優(yōu)的發(fā)酵條件。發(fā)酵濾液對(duì)供試的3種蘋果枝干病害和6種其他植物病原菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性，具抑菌廣譜性。S.rocheiA-m1 抑菌譜較廣、抑菌活性高，具有防治部分作物真菌性病害的應(yīng)用潛力。