施星月，陳翀，劉峰林，呂帝，徐杰，韓正祥

0 引言

神經(jīng)纖毛蛋白1（Neuropilin-1,NRP-1）是一種多功能的跨膜糖蛋白，在生理和病理條件下都可作為多種生長因子或其他配體的共受體而發(fā)揮不同的生物學功能，在免疫、腫瘤、血管發(fā)育和神經(jīng)等系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1]，前期研究表明NRP-1在乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胃腸道腫瘤等多種人類腫瘤組織及癌細胞株中均過表達，但在相應的正常組織中表達較低，并與腫瘤的預后相關，因此NRP-1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2-5]。

Treg細胞（CD4+CD25+CD127-Treg）是一群具有低反應性及免疫抑制功能的調節(jié)性T細胞，能阻斷機體抗腫瘤免疫，達到腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用[6]。樹突狀細胞（dendritic cell,DC）是一種抗原呈遞細胞，目前人類外周血DC細胞主要分為髓樣樹突狀細胞（myeloid dendritic cell,MDC）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytdid dendritic cell,PDC)（CD123+CD303+CD304+）2個亞型，其中PDC在誘導抗原特異性抗腫瘤免疫反應上發(fā)揮重要作用[7]。但有關NRP-1與Treg、PDC在非小細胞肺癌方面的研究卻鮮見報道，本研究檢測了非小細胞肺癌患者和健康體檢者外周血中NRP-1在Treg、PDC的表達，旨在探討其在非小細胞肺癌發(fā)生中免疫調節(jié)的可能機制，并分析其與臨床參數(shù)的相關性，為NSCLC病情監(jiān)測、治療策略、療效判斷及預后評估提供新的相關指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年6月—2019年9月就診于徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院的49例均經(jīng)手術、纖維支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺活檢確診為非小細胞肺癌患者的外周血，具有完整的臨床、影像學、病理及隨訪資料。前期均未接受針對癌癥的治療（化療、放療以及生物免疫治療等），近3月內未使用過免疫增強劑。全部符合世界衛(wèi)生組織（WHO）的診斷標準。49例非小細胞肺癌患者年齡30～74歲，中位年齡61歲。其中男32例、女17例。按2018年國際抗癌聯(lián)盟TNM肺癌病理分期分為：Ⅰ期18例、Ⅱ12例、Ⅲ期11例、Ⅳ期8例。同時收集徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院33例健康體檢者外周血作為對照組，年齡22～70歲，中位年齡55歲。其中男17例、女16例。本研究獲得徐州醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 實驗材料

FITC/Alexa Fluor 488-A標記的抗人CD4單克隆抗體試劑、APC標記的抗人CD25單克隆抗體試劑、Alexa Fluor 700標記的抗人CD3單克隆抗體試劑及PE.Cy5標記的抗人CDl27單克隆抗體試劑均購自美國Biolegend公司；Brilliant Violet 421標記的抗人CD304（NRP-1）單克隆抗體試劑、PEcy7標記的抗人CD123單克隆抗體試劑、APC-Fire750標記的抗人CD303單克隆抗體試劑、libIlr流式細胞儀及percp-cy5.5標記的抗人CD45單克隆抗體試劑均購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

清晨空腹抽取外周靜脈血2 ml（肝素抗凝），于2 h內檢測。取200 μl靜脈血于流式管中，加抗體2 μl混勻，暗處孵育20 min；加紅細胞裂解液2 ml，混勻，充分裂解紅細胞；加2 ml PBS混勻，2 000 r/min離心，洗滌3次，加 200 μl PBS混勻，置暗處4℃待上機，流式細胞儀檢測NRP-1的表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步采用LSD 法對有統(tǒng)計學意義的指標進行兩兩比較。分類計數(shù)資料均采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準均為P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NRP-l在肺癌患者和健康體檢者外周血Treg（CD4+CD25+CD127-Treg）細胞中的表達

結果顯示，肺癌患者外周血CD4+T表達為（34.19±7.61）%，Treg表達為（8.24±1.12）%，Treg上中NRP-1的表達為17.44±5.04；健康體檢者外周血CD4+T表達為（38.91±4.85）%，Treg表達為（5.25±0.82）%，Treg中NRP-1的表達為12.69±3.29，見圖1。

2.2 對照組和非小細胞肺癌組臨床指標比較

對照組外周血CD4+T、PDC的表達均明顯高于非小細胞肺癌組，對照組外周血Treg/CD4+T表達與NRP-1的表達均明顯低于非小細胞肺癌組（均P<0.05），見表1。

表1 對照組和肺癌組臨床指標比較 (±s)Table 1 Comparison of clinical indicators between control group and NSCLC group (±s)

表1 對照組和肺癌組臨床指標比較 (±s)Table 1 Comparison of clinical indicators between control group and NSCLC group (±s)

2.3 Treg/CD4+T、NRP-1、PDC與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系

2.3.1 Treg/CD4+T 49 例NSCLC外周血中Treg/CD4+T表達情況與腫瘤最大徑、有無淋巴結轉移、TNM分期、分化程度有關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著TNM分期的升高和分化程度的降低，TregCD4+T的表達呈增高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

圖1 肺癌患者(A)與健康體檢者(B)外周血Treg細胞膜中NRP-l的表達流式圖Figure 1 Flow cytometry of NRP-l expression in Treg cell membrane in peripheral blood of NSCLC patients(A) and healthy subjects(B)

2.3.2 Treg中NRP-1的表達 49例NSCLC外周血Treg中NRP-1的表達情況與腫瘤最大徑、有無淋巴結轉移、TNM分期、分化程度有關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），隨著TNM分期的升高和分化程度的降低，NRP-1的表達呈增高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3.3 PDC中NRP-1的表達 49例NSCLC外周血PDC中NRP-1的表達情況與腫瘤最大徑、有無淋巴結轉移、TNM分期有關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著TNM分期的升高，NRP-1在PDC中的表達呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表2 Treg/CD4+T、NRP-1與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關系 (±s)Table 2 Correlation of Treg/CD4+T,NRP-1 with clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

表2 Treg/CD4+T、NRP-1與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關系 (±s)Table 2 Correlation of Treg/CD4+T,NRP-1 with clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

Notes:a:compared withⅠ,b:compared with Ⅱ,c:compared with Ⅲ,all P<0.05;#:compared with G3,@:compared with G2,all P<0.05.

表3 NRP-1在PDC中的表達與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關系 (±s)Table 3 Relation between NRP-1 expression on PDC and clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

表3 NRP-1在PDC中的表達與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關系 (±s)Table 3 Relation between NRP-1 expression on PDC and clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

Notes:a:compared with Ⅰ,b:compared with Ⅱ,c:compared with Ⅲ,P<0.05.

2.4 Treg/CD4+T與CD4+T、NRP-1（Treg）、PDC的相關性分析

NSCLC患者Treg/CD4+T與NRP-1存在明顯的正相關關系（r>0,P<0.05）；Treg/CD4+T與PDC存在明顯的負相關關系（r<0,P<0.05），見表4。

3 討論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，死亡率在中國癌癥相關死亡率中排名第一。最常見的病理類型是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），主要包含鱗狀細胞癌（SCC）、腺癌（LAC）和大細胞癌（LCC）[8]。隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，化學治療、放射治療、靶向治療以及免疫治療雖然延長了一部分中晚期肺癌患者的生存期，然而5年生存率仍小于21%[9]。因此，尋找簡便易操作的預后評估指標具有重要的臨床意義。近年來，關于肺癌患者的免疫功能引起重視，研究表明惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)與機體的免疫功能缺陷有關，肺癌患者存在一定程度的免疫功能異常。隨著對肺癌免疫耐受機制的深入研究，CD4+T、NRP-1、Treg以及PDC在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的相互作用日益引起國內外學者的關注。

表4 Treg/CD4+T與CD4+T、NRP-1(Treg)、PDC的相關性分析Table 4 Correlation of Treg/CD4+T with CD4+T,NRP-1(Treg) and PDC

T淋巴細胞亞群的主要作用是調節(jié)機體免疫系統(tǒng)，在正常機體內各T細胞亞群保持動態(tài)平衡，維持機體正常細胞免疫應答。當 T淋巴細胞亞群比例出現(xiàn)異常時，殺傷腫瘤細胞、控制腫瘤生長的作用明顯減低[10]。CD3+代表總T細胞，主要分為 CD4+、CD8+T細胞兩大亞群，本研究檢測CD4+T（CD3+CD4+T）在非小細胞肺癌患者和健康體檢者的細胞比率，結果顯示非小細胞肺癌患者CD4+T細胞比率明顯低于健康體檢者，可能原因是腫瘤細胞誘導抑制性免疫微環(huán)境的形成。臨床上可通過檢測腫瘤患者外周血中T淋巴細胞亞群的變化來進一步評估患者免疫功能狀態(tài)和病情變化，可指導臨床使用免疫調節(jié)劑及其他藥物。

目前國內外大多數(shù)學者認為NRP-1是VEGF165高親和力受體，NRP-1通過NRP-1b1/b2結構域與絡氨酸激酶受體VEGFR2結合，促進腫瘤血管的生成，在腫瘤細胞增殖、黏附、遷移、侵襲中都發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移、復發(fā)有關[1]。Treg是一群具有獨特免疫負性調節(jié)功能的細胞，不但可抑制自身免疫性疾病的發(fā)生，而且還參與腫瘤的免疫調節(jié)[11]。近年來癌癥患者腫瘤組織及外周血中Treg的積累已被廣泛研究，并且與癌癥進展、腫瘤免疫逃逸、預后差和對治療缺乏反應有關。但迄今為止國內外研究中鮮見NRP-1和Treg兩者在非小細胞肺癌中表達的相關研究。本研究同時檢測了NRP-1和Treg兩者在非小細胞肺癌中表達的情況。結果發(fā)現(xiàn)，兩者在非小細胞肺癌表達明顯高于健康體檢者，隨著肺癌TNM分期的升高和分化程度的降低，NRP-l、Treg的表達呈明顯遞增趨勢。而且，相關性分析發(fā)現(xiàn)外周血中NRP-1表達與Treg細胞比率呈正相關（r>0,P<0.05）。NRP-1在癌癥患者外周血Treg中的表達上調。動物實驗已經(jīng)證明，NRP-1與Treg介導的腫瘤免疫逃逸機制有關，NRP-1充當VEGF的共受體，并已被證明在腫瘤的Treg浸潤中起重要作用，通過在Treg中表達的NRP-1起作用，腫瘤衍生的VEGF吸引NRP-1+Treg進入腫瘤組織[12]，增強腫瘤的免疫逃逸，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

在人外周血中，NRP-1在PDC細胞上高表達，當前有許多標記用于識別PDC，包括CD123、BDCA-2（CD303）和NRP1（CD304）。研究表明NRP-1可通過與腫瘤細胞衍生出的VEGF的相互作用而參與PDC的腫瘤浸潤，而Treg則可通過與NRP-1的相互作用，弱化DC活化效應性T細胞的功能，最終使效應性淋巴細胞活化不足，抗腫瘤抗原效應減弱[1]。本實驗數(shù)據(jù)提示非小細胞肺癌外周血Treg與PDC呈明顯負相關（r<0,P<0.05）。近年來，程序性死亡受體1（programmed death 1,PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand 1,PD-L1）免疫檢查點抑制劑成為肺癌免疫治療研究熱點，PD-1在活化后的CD8+T、CD4+T、B、DC及單核細胞等諸多免疫細胞上表達[13-14]。胸腺來源的Treg細胞（tTreg）可表達PD-1。PD-1/PD-L1相互作用有助于使CD4+T細胞轉化成Treg細胞，Treg細胞上表達的PD-1還可以與T細胞上表達的PD-L1相互作用，以介導免疫抑制，在抗原識別過程中，NRP-1表達促進Treg與DC的相互作用，從而抑制T細胞活化[15]。但非小細胞肺癌患者外周血中NRP-1與Treg、PDC、PD-1相互作用的具體機制，相關文獻報道較少，因此明確其相互作用的關系可能有利于對非小細胞肺癌免疫治療。

NRP-1在人外周血Treg、PDC細胞表達的研究結果有顯著差異，提示NRP-1通過與Treg、PDC的廣泛相互作用在免疫調節(jié)和功能中起著重要作用。但NRP-1與Treg、PDC之間的作用機制有待進一步研究，從而使抗NRP-1治療成為腫瘤治療的新靶點和途徑，為臨床尋找新的治療方法提供理論依據(jù)。