王雪剛 張新枝 楊澍 甘蘇琴 劉詩(shī) 郝坤艷 周彬 于樂(lè)成

近年來(lái)，隨著乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)抗病毒藥物，主要是核苷(酸)類(lèi)似物(Nucleoside/nucleotide Analogues, NAs)的廣泛使用，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的病毒復(fù)制及肝臟炎癥均得到了很好的控制[1-2]。在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等肝生化指標(biāo)持續(xù)正常、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)下降不明顯、HBV DNA和HBeAg檢測(cè)不出的情況下，如何更精準(zhǔn)地監(jiān)測(cè)患者病毒復(fù)制情況和選擇合理的停藥時(shí)機(jī)，是目前臨床實(shí)踐中常見(jiàn)的問(wèn)題[3]。隨著這些新問(wèn)題的提出，HBV RNA作為新的可能反映肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA水平的血清學(xué)指標(biāo)，近年來(lái)迅速成為臨床和相關(guān)基礎(chǔ)研究人員關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。

HBV是一種DNA病毒，近年來(lái)一直以血清HBV DNA水平作為反映患者病毒復(fù)制水平的指標(biāo)。血清HBV RNA的檢測(cè)早在1994年就有文獻(xiàn)報(bào)道，研究者利用PCR和RT-PCR可以同時(shí)從HBV相關(guān)肝癌和CHB患者血清檢測(cè)到HBV DNA和HBV RNA[4-5]。由于當(dāng)時(shí)對(duì)HBV RNA臨床意義的認(rèn)知不如HBV DNA和HBsAg明確，所以在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里未得到臨床醫(yī)生和科研工作者應(yīng)有的重視。2015年以來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)在HBV DNA獲得持續(xù)抑制的患者中，仍然能檢測(cè)到血清HBV RNA，其存在的意義和價(jià)值立即引起了臨床醫(yī)生和研究者的極大興趣[6-8]。

隨著對(duì)血清HBV RNA臨床應(yīng)用的關(guān)注，許多檢測(cè)HBV RNA的方法和試劑盒也應(yīng)運(yùn)而生。我們對(duì)比了文獻(xiàn)報(bào)道中常用的“互補(bǔ)DNA末端快速擴(kuò)增法”(rapid amplication of complimentary DNA-ends，RACE)和一種Sansure國(guó)產(chǎn)試劑盒檢測(cè)CHB患者血清HBV RNA的效能，采樣兩種方法對(duì)治療和未治療患者血清中的HBV RNA水平檢測(cè)值進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期探討不同檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用中的一致性和可替代性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年6—9月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝病門(mén)診就診的CHB患者，排除接受干擾素、合并丙型肝炎病毒或人類(lèi)免疫缺陷病毒等其他病毒感染的患者。共納入101例，其中未接受NAs治療患者39例，曾經(jīng)或正在接受NAs治療者62例，均為參加常規(guī)隨訪(fǎng)的患者。所有患者均已簽署知情同意書(shū)，項(xiàng)目經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、HBV DNA及HBsAg等血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)

三、血清HBV RNA檢測(cè)

第二種方法采用圣湘公司HBV RNA定量試劑盒(科研用HBV RNA PCR-熒光探針?lè)ǘ繖z測(cè)試劑盒，Sansure法試劑盒)，在公司技術(shù)人員指導(dǎo)下，完全按照試劑盒說(shuō)明的步驟操作。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄 HBV 核酸中的 pgRNA(經(jīng) DNA 酶消化)，利用針對(duì) HBV pgRNA 序列設(shè)計(jì)的一組特異性引物與熒光探針，配以 PCR 反應(yīng)液，應(yīng)用一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn) HBV pgRNA 的定量檢測(cè)。PCR 檢測(cè)體系含有陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照(內(nèi)標(biāo))和四個(gè)定量參考品，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因來(lái)監(jiān)測(cè)提取核酸中是否具有 PCR 抑制物，評(píng)價(jià)核酸提取的質(zhì)量，避免 PCR 假陰性。PCR 檢測(cè)體系含有內(nèi)參比熒光 ROX，用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動(dòng)分析報(bào)告熒光與內(nèi)參比熒光ROX的比值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及統(tǒng)計(jì)繪圖，組間均值比較采用t檢驗(yàn)；HBV DNA與HBV RNA及兩種HBV RNA檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性采用R值進(jìn)行計(jì)算；兩種方法檢測(cè)的HBV RNA 在未治療和治療患者中的一致性用Bland-Altman圖表示；兩種HBV RNA之間的關(guān)系采用線(xiàn)性回歸方程表示。

結(jié) 果

一、患者一般情況

101例患者的性別、年齡分布、HBeAg陽(yáng)性的人數(shù)，以及ALT、HBsAg、HBV DNA水平的中位數(shù)和范圍見(jiàn)表1。

表1 治療組和未治療組患者的一般情況

二、治療組和未治療組的HBsAg水平和HBV DNA水平

兩組患者的HBsAg水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0023)，未治療組的HBsAg平均值明顯高于治療組(3.382與2.691 lg U/L)。HBV DNA水平在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，未治療組的HBV DNA平均值明顯高于治療組(5.842對(duì)1.656 lg IU/mL)。見(jiàn)圖1。

圖1 治療組和未治療組患者HBsAg和HBV DNA水平比較

三、兩種HBV RNA檢測(cè)方法的檢測(cè)效能

按照Sansure法的試劑說(shuō)明，其線(xiàn)性范圍為 3×102～1.00×109拷貝/mL，檢測(cè)下限(Low level of detection, LOD)為100拷貝/mL. 本實(shí)驗(yàn)室按照文獻(xiàn)建立的RACE法的線(xiàn)性范圍為4×103～4×1010拷貝/mL，LOD為3 890 拷貝/mL。雖然數(shù)值顯示RACE法比Sansure法的LOD更高，但是在本研究中檢測(cè)相同的臨床樣本，RACE法比Sansure法的檢測(cè)值平均高出0.68 lg 拷貝/mL。

四、治療組和未治療組的HBV RNA水平

兩組患者的血清HBV RNA水平在治療組和未治療組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但差異不如HBV DNA水平的組間差異顯著(P=0.0134)。兩種方法相比，RACE法比Sansure法檢測(cè)到的陽(yáng)性患者更多，分別在101例患者中檢測(cè)出60和56例。RACE法比Sansure法的檢出平均檢值更高，分別為3.16 lg 拷貝/mL和2.53 lg 拷貝/mL。治療組中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分別為2.259 lg 拷貝/mL和1.650 lg 拷貝/mL(P=0.153 2)；未治療組中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分別為4.583 lg 拷貝/mL和3.878 lg 拷貝/mL(P=0.308 6)。兩種方法檢測(cè)值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

例如：在《數(shù)學(xué)廣角——搭配（二）》一課的課堂教學(xué)過(guò)程中，我就是以構(gòu)建生活化教學(xué)情境的方式，促進(jìn)生態(tài)化小學(xué)數(shù)學(xué)課堂的構(gòu)建的。

圖2 治療組和未治療組患者HBV RNA水平比較

五、治療組和未治療組患者HBV DNA與HBV RNA水平的相關(guān)性

在治療組中血清HBV DNA水平與HBV RNA水平?jīng)]有相關(guān)性，RACE法R2= 0.440 6，Sansure法R2= 0.508 1(圖3A)。

在未治療組中，兩種方法均顯示血清HBV DNA水平與HBV RNA水平顯著相關(guān)，RACE法R2=0.844 8，Sansure法R2= 0.866 7(圖3B)。

將治療組和未治療組混合分析，相關(guān)性不佳，RACE法R2= 0.610 0，Sansure法R2= 0.653 0(圖3C)。

RACE法和Sansure法的HBV RNA檢測(cè)值具有顯著的相關(guān)性?？傮w上兩種方法檢測(cè)值經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)為R2=0.8740，具有顯著相關(guān)性(圖3D)。

兩種方法在治療和未治療患者中的一致性采用Bland-Altman圖表示(圖4)。以?xún)煞N測(cè)量結(jié)果的差值為縱軸，以測(cè)量結(jié)果的均數(shù)為橫軸，繪制散點(diǎn)圖，用虛線(xiàn)標(biāo)注出95%一致性界限(95% limits of agreement, 95% LoA)。95% LoA的范圍較窄(兩個(gè)目標(biāo)之間的差值在治療組為-1.789到0.22 lg 拷貝/mL，未治療組為-2.25到0.53 lg 拷貝/mL)。以RACE法為基準(zhǔn)，Sansure法的偏差在治療組為-0.78 lg 拷貝/mL，在未治療組為-0.86 lg 拷貝/mL。偏差值均小于2，兩種檢測(cè)值的一致性好(圖4)。經(jīng)deming線(xiàn)性回歸分析，以Race法結(jié)果作為X，以Sansure法結(jié)果作為Y，兩者的回歸方程為Y=0.9189X-0.3754。

圖3 HBV DNA水平與HBV RNA水平的相關(guān)性及兩種HBV RNA檢測(cè)值的相關(guān)性

圖4 兩種檢測(cè)方法HBV RNA水平在治療和未治療患者中的Bland-Altman一致性分析

討 論

HBV在復(fù)制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生5種HBV mRNA，在早期的研究中，研究者們雖然利用RT-PCR檢測(cè)到血清中存在HBV RNA，但未進(jìn)一步探索其具體組成。近年報(bào)道血清HBV RNA有3.5 kb pgRNA、截?cái)嗟腞NA、剪切的RNA等多種存在形式[10-12]。2016年Wang 等利用HBV 特異性引物分別擴(kuò)增并定量檢測(cè)血清總HBV RNA(包括上述5種mRNA)和HBV 3.5 kb mRNA，發(fā)現(xiàn)總HBV RNA的量與3.5 kb mRNA的量無(wú)明顯差異，因此推斷血清中HBV RNA主要為3.5 kb mRNA，而3.5 kb mRNA包括兩種mRNA，即pre-C mRNA和pgRNA。Wang等進(jìn)一步設(shè)計(jì)HBV特異性引物分別擴(kuò)增pre-C mRNA與pgRNA的總和，結(jié)果未檢測(cè)到pre-C mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物，因此證實(shí)血清HBV RNA主要是3.5 kb pgRNA[7]。2018年，Bai等報(bào)道血清中HBV RNA主要是pgRNA或3’端已被降解的pgRNA，長(zhǎng)度從3.5 kb到幾百bp之間呈現(xiàn)出異質(zhì)性，這些RNA主要存在于核心顆粒中，大多數(shù)以抗原抗體復(fù)合物的形式存在于血清中，少數(shù)也存在于完整的病毒顆粒中[13]。

本文應(yīng)用的RACE法即是只能檢測(cè)帶A尾的HBV RNA，由于其第一步逆轉(zhuǎn)錄時(shí)的引物只能靶向A尾，因此只有帶A尾的RNA能被檢測(cè)出來(lái)。而本文應(yīng)用的Sansure法則是需要DNA酶消化的一步法RT-qPCR法，該方法的好處是可以同時(shí)檢測(cè)帶A尾和不帶A尾的RNA；缺點(diǎn)是應(yīng)用DNA酶消化后，一方面需要質(zhì)控HBV DNA是否已經(jīng)被完全消化干凈(試劑盒設(shè)計(jì)了相關(guān)質(zhì)控對(duì)照)，另一方面需考慮DNA酶對(duì)HBV RNA也有消耗作用(Sansure試劑盒無(wú)相關(guān)質(zhì)控對(duì)照)，這會(huì)導(dǎo)致HBV RNA的水平被低估。從理論上講，Sansure法能檢測(cè)的RNA種類(lèi)更多，其水平應(yīng)該更高。但是本研究結(jié)果顯示RACE法在未治療和治療患者中的檢測(cè)值均高于Sansure法。除了考慮到不同方法的敏感性不同，還需考慮DNA酶對(duì)HBV RNA的消耗作用可能影響了Sansure法的檢測(cè)水平。

另外，我們也注意到，治療組和未治療組的HBV DNA水平具有顯著差異，而HBV RNA的水平差異沒(méi)有HBV DNA顯著，在治療組患者中這種趨勢(shì)更加明顯。這種情況的出現(xiàn)主要是由于在接受治療的患者中大多數(shù)HBV DNA已經(jīng)轉(zhuǎn)陰，但是部分患者HBV RNA仍然是陽(yáng)性。在62例治療組患者中，HBV DNA陽(yáng)性患者為21例，Sansure法檢測(cè)的陽(yáng)性患者為26例，RACE法檢測(cè)的陽(yáng)性患者為31例。這使得各組的平均值也有所不同，提示Sansure法的敏感性仍有改進(jìn)和提升空間。

兩種檢測(cè)方法在治療組患者中均比HBV DNA能檢測(cè)到更多陽(yáng)性患者，這主要是由于NAs治療阻斷了HBV RNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而對(duì)從cccDNA到HBV RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程并沒(méi)有影響。由于HBV RNA是cccDNA的直接下游產(chǎn)物，患者從HBV DNA轉(zhuǎn)陰到HBV RNA轉(zhuǎn)陰還需要cccDNA的耗竭作為中間過(guò)程，我們最近的一項(xiàng)研究闡明了這中間的時(shí)間差[15]。在血清HBV DNA與HBV RNA水平的相關(guān)性分析中，只在未治療組患者中觀察到了兩者的顯著相關(guān)性，而在治療組患者中未觀察到相關(guān)性。這也與上述NAs治療阻斷HBV RNA逆轉(zhuǎn)錄的機(jī)制有關(guān)。這部分結(jié)果也與雅培公司的報(bào)道一致[16]。雖然實(shí)驗(yàn)效能評(píng)價(jià)中LOD數(shù)值Sansure法比RACE法更低，但是相同樣本用兩個(gè)方法同時(shí)檢測(cè)的檢測(cè)值則是RACE法更高，這主要是由于兩個(gè)方法使用的標(biāo)準(zhǔn)品不一致：RACE法采用本實(shí)驗(yàn)室自己合成的標(biāo)準(zhǔn)品，Sansure法采用相應(yīng)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，其線(xiàn)性范圍和LOD值并不具有可比性。如果HBV RNA檢測(cè)能像HBV DNA的檢測(cè)系統(tǒng)一樣，有世界衛(wèi)生組織(World health organization, WHO)提供的統(tǒng)一的以IU為單位的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定，則不同平臺(tái)的結(jié)果，其線(xiàn)性范圍和LOD之間才具有可比性[17]。

雖然從原理上來(lái)說(shuō)，本研究的兩種方法檢測(cè)的是不同種類(lèi)的HBV RNA，即Sansure法可同時(shí)檢測(cè)帶A尾和不帶A尾的RNA，而RACE法只能檢測(cè)到帶A尾的RNA。但是我們的結(jié)果顯示，總體上Sansure法和RACE法的相關(guān)性和一致性較好，并可通過(guò)線(xiàn)性回歸公式由一個(gè)檢測(cè)值推算出另一個(gè)檢測(cè)值。雅培公司建立了一種自動(dòng)化的、同時(shí)靶向X區(qū)和C區(qū)的HBV RNA檢測(cè)方法，其結(jié)果用HBV DNA的標(biāo)準(zhǔn)品作為參比時(shí)，在治療的患者中HBV RNA的水平比HBV DNA平均高(2.45 ± 1.13)lg[16]。但在我們的結(jié)果中，治療組患者中除了HBV DNA陰性的樣本外，Sansure法和RACE法的平均檢測(cè)值均低于HBV DNA的檢測(cè)值。說(shuō)明這兩種檢測(cè)方法的效能仍需進(jìn)一步提高。

在未接受NAs治療的患者中，血清HBV DNA水平與HBV RNA水平具有很好的相關(guān)性，因此用HBV DNA水平來(lái)檢測(cè)HBV的復(fù)制水平是很可靠的辦法。但是在接受NAs治療的很多患者血清HBV DNA已經(jīng)低于LOD，這時(shí)候血清HBV RNA即成為更有效、更可靠的監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制和預(yù)測(cè)臨床療效的標(biāo)志物。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RACE法在較多的研究報(bào)道中被應(yīng)用于預(yù)測(cè)NAs和干擾素治療應(yīng)答或者病程進(jìn)展，具有較好的預(yù)測(cè)效能。目前尚未見(jiàn)Sansure法應(yīng)用于臨床的報(bào)道。另外，兩種方法均未見(jiàn)應(yīng)用于NAs停藥復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)[6, 8, 18-19]。鑒于目前尚無(wú)HBV RNA的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)品，也沒(méi)有批準(zhǔn)用于臨床檢測(cè)的商業(yè)試劑盒，不同方法的臨床應(yīng)用場(chǎng)景還需進(jìn)一步探索。因此，較合理的做法是我們?cè)趹?yīng)用HBV RNA水平作為標(biāo)志物用于病情監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)應(yīng)答之前，首先需要對(duì)不同的方法學(xué)進(jìn)行比較和評(píng)估，然后再挑選出合適的方法應(yīng)用于臨床相關(guān)研究。