張迪，劉倩倩，彭瑾瑾，劉志，劉曉偉，劉偉

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽 110001）

百草枯 （paraquat，PQ） 是一種高毒性的有機雜環(huán)類除草劑，由于其低成本和高效的除草性能，在發(fā)展中國家廣泛應用［1］。PQ中毒的死亡率高達60%～80%。肺臟是PQ中毒后損傷的主要靶器官，早期為明顯肺水腫、肺出血等急性肺損傷表現(xiàn)，后期發(fā)展為不可逆的肺間質纖維化而導致死亡［2］。目前PQ中毒肺損傷機制并不完全清楚。在肺損傷的病理過程中，細胞外基質發(fā)揮維持肺泡結構及組織損傷修復等重要的生物學作用［3］。肌腱蛋白C（tenascin-C，TNC） 作為一種細胞外基質成分，當氧化損傷、組織修復以及炎癥介質刺激時，其表達明顯升高［4-5］。此外，在前期研究［6］中發(fā)現(xiàn)，PQ中毒患者血清TNC表達明顯升高，而且是中毒預后的獨立危險因素。目前，關于TNC在PQ引起的肺損傷中的表達規(guī)律及機制分析國內外尚無報道。本研究中將利用PQ中毒小鼠模型，探討TNC在PQ中毒肺損傷小鼠模型中的表達規(guī)律，這將有助于對PQ中毒肺損傷機制的進一步理解，并為診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6 雄性小鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物部。RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，蛋白標準品 （碧云天生物技術研究所），SDS-PAGE上樣緩沖液 （康為世紀），蛋白Marker （美國Thermo Fisher Scientific公司），ECL發(fā)光液底物 （美國Bio-rad公司），PQ （美國Sigma公司），TNC、α-平滑肌肌動蛋 白 （α-smooth muscle actin，α-SMA）、轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）、核因子-κB p65 （nuclear factorκB p65，NF-κB p65） 抗體 （英國Abcam公司），GAPDH抗體、辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶羊抗兔IgG抗體 （美國Proteintech公司），TRIzol試劑 （美國Life Technologies公司），PrimeScript RT Master Mix，TB Premix Ex TaqⅡ（日本TaKaRa公司），免疫組化試劑盒 （北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PQ小鼠模型建立：C57BL/6 雄鼠 （70只），6～8周，體質量18～22 g，標準飲食，生活環(huán)境清潔且12 h明/暗交替，室溫 （23± 0.5） ℃，濕度50%±5%。實驗組小鼠經(jīng)腹腔注射30 mg/kg的溶解于無菌生理鹽水的PQ，對照組同樣方式給予相同體積無菌生理鹽水。在造模后2 d、7 d、14 d 和28 d，每個時間點5只小鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉 （60 mg/kg） 后，腹主動脈放血處死，取整個肺組織用于后續(xù)檢測。左肺經(jīng)10%中性甲醛固定后包埋于石蠟中用于HE，Masson三色染色和免疫組織化學 （immunohistochemistry，IHC） 檢測；右肺分為2部分，分別用于mRNA和蛋白提取。所有動物實驗均獲得中國醫(yī)科大學倫理機構委員會批準。

1.2.2 蛋白檢測：右上肺加入RIPA裂解液緩沖液，經(jīng)超聲破碎后，裂解液用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度。等體積等蛋白量的樣品 （20 μL，100 μg）經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉膜到聚偏二氟乙烯膜 （polyvinylidene fluoride，PVDF），一抗TNC （1 ∶1 000），α-SMA （1 ∶1 000），TGF-β1 （1 ∶1 000），NF-κB p65 （1 ∶1 000），GAPDH （1 ∶5 000），4 ℃過夜孵育后，帶辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育2 h，在化學發(fā)光試劑作用下發(fā)光顯影檢測蛋白條帶，并用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。

1.2.3 基因檢測：右下肺經(jīng)TRIzol試劑裂解后，用異丙醇沉淀法提取總RNA。定量后，cDNA反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄，SYBR PCR定量試劑盒檢測TNC基因表達量。管家基因為GAPDH，對照組TNC表達量為標準。引物序列見表1。

表1 TNC及GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of TNC and GAPDH

1.2.4 病理學檢測：左肺的石蠟包埋切成5 μm厚的切片，進行HE和Masson三色染色?？酒?、脫蠟水化、清洗、蘇木素伊紅染色、脫水透明及封片，進行HE染色。Masson染色，烤片、脫蠟水化同HE染色，酸性高錳酸鉀5 min，1%草酸漂白2 min，自來水沖洗15 min，蒸餾水沖洗，Masson染色液中浸泡5 min，0.2%冰醋酸快速沖洗，1%磷鎢酸浸泡分化5 min，0.2%冰醋酸快速沖洗，2%苯胺蘭冰醋酸浸泡5 min，0.2%冰醋酸快速沖洗至褪色，迅速在95%的乙醇分化，迅速無水乙醇脫水，60 ℃恒溫箱過夜，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，拍照。IHC中，切片脫蠟，水化，檸檬酸修復液中煮沸5 min進行抗原修復，TNC一抗稀釋濃度為1 ∶50，其余步驟根據(jù)免疫組化試劑盒說明書操作進行TNC抗原的組織化學染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)比較用兩樣本t檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗結果至少重復3次。

2 結果

2.1 PQ中毒模型成功建立

腹腔注射PQ是小鼠造模的經(jīng)典方法［7］。肺組織的HE結果 （圖1） 可見對照組肺泡結構正常，肺泡間隔不厚，肺泡壁完整，呈現(xiàn)漁網(wǎng)狀。PQ作用2 d后，肺泡間隔增厚，結構尚完整，少量炎癥細胞浸潤，肺泡腔出血。7 d肺泡結構嚴重損害，肺泡上皮細胞受損，大量炎癥細胞滲出。14 d肺泡間隔明顯增厚，滲出吸收，浸潤細胞明顯增多，在損傷的肺泡間隔可見一些基質纖維膠原成分。28 d肺泡結構整體完整，浸潤細胞不多，但部分肺泡依然可見略厚的肺泡間隔。Masson染色可見，對照組肺泡區(qū)幾乎無染色。PQ注射后，7 d藍染增多，主要集中在血管周圍損傷嚴重的肺泡區(qū)。14 d在增厚的肺間質區(qū)明顯藍染，其余時間點不明顯，見圖1。HE和膠原染色結果提示PQ中毒肺損傷小鼠模型的成功建立，早期 （7 d）呈現(xiàn)急性炎癥損傷表現(xiàn)，后期為纖維化改變?yōu)橹鳌?/p>

2.2 PQ中毒模型中相關炎癥和纖維化介質表達情況

圖1 PQ中毒小鼠模型肺組織病理染色及膠原染色 x100Fig.1 Pathological staining and collagen deposition in lung tissues of PQ mice model x100

Western blotting檢測結果 （圖2） 顯 示，NF-κB p65表達水平與對照組相比在2 d （1.466±0.147 7 vs 0.835±0.094 4，P< 0.05） 和7 d （1.284±0.034 0 vs 0.835±0.094 4，P< 0.01） 明顯升高，有統(tǒng)計學意義，并且在2 d達高峰。在2 d之后的表達開始下降，在14 d（0.853±0.064 3 vs 0.835±0.094 4，P> 0.05） 和28 d（0.792±0.063 0 vs 0.835±0.094 4，P> 0.05） 后與對照組持平，回歸正常水平。α-SMA在造模后的28 d內表達呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，在早期無明顯升高，分別為2 d （1.315±0.453 vs 0.900±0.208 2，P> 0.05），7 d（1.467±0.524 6 vs 0.900±0.208 2，P> 0.05），均無統(tǒng)計學意義。14 d （2.804±0.467 7 vs 0.900±0.208 2，P< 0.05） 和28 d （3.296±0.735 0 vs 0.900±0.208 2，P< 0.05）呈現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的高表達。TGF-β1與對照組相比，從2 d （2.694±0.194 5 vs 1.000±0.152 8，P< 0.01），7 d （1.849±0.088 8 vs 1.000±0.152 8，P< 0.01），14 d （1.944±0.098 4 vs 1.000±0.152 8，P< 0.01），并一直持續(xù)到28 d （2.467±0.260 3 vs 1.000±0.152 8，P< 0.01），均為有統(tǒng)計學意義的高表達。

圖2 PQ中毒小鼠模型肺組織中相關炎癥纖維化指標的蛋白檢測結果Fig.2 Relative protein expression levels of cytokines in mouse lung tissue post PQ administration

2.3 TNC在PQ中毒肺組織中高表達

對照組中TNC僅微量表達。但是PQ中毒小鼠肺組織中TNC在基因和蛋白水平均明顯高表達，見圖3?；虻谋磉_高峰早于蛋白表達，在2 d達高峰。TNC基因表達量與對照組相比各組結果如下：2 d （5.038±0.421 8 vs 1.212±0.427 7，P< 0.01），7 d （3.508±0.640 5 vs 1.212±0.427 7，P< 0.05），14 d （2.177±0.915 8 vs 1.212±0.427 7，P> 0.05），28 d（1.351±0.201 2 vs 1.212±0.427 7，P> 0.05），2 d和7 d時差異有統(tǒng)計學意義，其余無統(tǒng)計學意義。TNC蛋白從2 d （2.575±0.435 1 vs 1.000±0.471 5，P< 0.05）開始升高，7 d （5.525±0.256 0 vs 1.000±0.471 5，P<0.01） 達高峰，之后表達降低。在14 d （2.511±0.568 9 vs 1.000±0.471 5，P> 0.05） 和28 d （1.790±0.178 9 vs 1.000±0.471 5，P> 0.05） 與對照組比較，蛋白表達量無統(tǒng)計學差異。IHC結果可見，對照組幾乎無黃染，PQ作用后的各個時間點均可見一定程度的黃染，7 d黃染最為明顯，并且主要分布于損傷的肺間質區(qū)。

圖3 PQ中毒小鼠模型中TNC的表達及分布Fig.3 TNC expression in lung tissues of mouse model

3 討論

本研究通過病理染色和膠原染色，證實了小鼠PQ中毒肺損傷模型建立成功。NF-κB p65作為炎癥過程啟動和激活的關鍵因子［8］，在PQ中毒后2 d，肺組織中出現(xiàn)表達高峰，7 d后逐漸下降，這與PQ通過細胞氧化應激損傷導致上皮細胞壞死和早期炎癥的病理改變相一致。提示急性炎癥反應是PQ中毒肺損傷的始動因素，早期合理干預 （48 h之內） 可能是減少肺臟進一步損傷和改善預后的關鍵。

在14 d和28 d，α-SMA作為代表著成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的標志物，表達開始升高，反應了PQ中毒后期的損傷開始從炎癥向纖維化、基質沉積、組織修復轉化［9］。TGF-β1在早期炎癥階段誘導細胞外基質表達，刺激成纖維細胞增殖并分化為肌成纖維細胞［10］，從而分泌大量膠原蛋白，造成肺泡間質增厚，過量的表達可能會使組織修復失衡，出現(xiàn)肺纖維化的病理改變。本研究結果也證實TGF-β1在PQ中毒誘導肺損傷過程中于早期 （2 d） 表達開始升高，并且持續(xù)高表達至染毒后28 d，提示TGF-β1參與了炎癥和纖維化整個病理過程。

TNC作為一種細胞外大分子基質蛋白，主要分布在組織的細胞外基質區(qū)，與基質蛋白、膜信號傳導蛋白和小分子的細胞因子相互結合，并啟動一些信號通路和調節(jié)細胞增殖、遷移、黏附和分化［4］。盡管已經(jīng)有研究［11-12］表明，TNC參與多個疾病纖維化過程，但在PQ中毒肺損傷及纖維化過程中還未被關注。本研究結果表明，PQ中毒后7 d TNC達到表達峰值，并且主要分布在損傷嚴重區(qū)域的肺泡上皮下。同時比較TNC與其他3個重要炎癥纖維化相關因子的時間表達趨勢，發(fā)現(xiàn)TNC與NF-κB p65和TGF-β1表達趨勢具有一定相似性。另外有研究［13］證實NF-κB和TGF-β1是參與TNC基因表達調控的啟動因子，因而TNC升高是對早期炎癥損傷后的反應性升高。此外，在TNC敲除小鼠的博來霉素模型中，TGF-β1的表達是降低的［14］。結合既往研究和本研究結果，推測在PQ中毒肺損傷過程中，TNC與TGF-β1之間存在著相互促進作用，TNC貫穿PQ誘導的肺損傷的炎癥和纖維化2個階段，存在著被激活以及調控其他相關因子表達的雙重作用。但是本研究發(fā)現(xiàn)TNC與TGF-β1的表達峰值時間并不完全一致，在14 d后TNC表達明顯下降，并趨于正常，但是TGF-β1的表達仍持續(xù)高表達，這表明兩者之間還存在其他因子的作用，并非為單一相互促進作用。TNC高表達主要發(fā)生在肺臟從炎癥損傷向纖維化轉變的關鍵時間點 （7 d），高度提示TNC可能對PQ中毒肺損傷中早期炎癥損傷能否轉變?yōu)楹笃诟咧滤缆实姆卫w維化發(fā)揮著調控作用。但是TNC在這一過程中的具體作用機制還需要進一步的深入研究。

綜上，本研究首次證明TNC在PQ中毒肺損傷小鼠模型中高表達，參與了PQ中毒肺損傷的過程，并展示了TNC在PQ中毒肺損傷過程中的表達規(guī)律，推測TNC在此過程中的作用和TGF-β1密切相關。TNC在PQ中毒肺損傷中的作用或許可以成為臨床治療的關鍵靶點。