葉 陽，宋新剛，張立恒，任德強

（哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025）

1 材料與方法

1.1 材料

病毒：PRVR株，哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司供應，BHK21細胞增殖后建立種子批，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞：PK15細胞北京世紀元亨防疫有限公司提供；ST細胞、BHK21細胞、RK13細胞為本公司自有。雞胚成纖維細胞取自SPF雞胚，按原代細胞常規(guī)制備方法獲得。

胰酶與細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基：購自GIBCO公司，注射用水配制后過濾除菌；新生牛血清品牌為四季青。

儀器設備：T75一次性細胞培養(yǎng)瓶與96孔細胞培養(yǎng)板，康寧公司；CO2培養(yǎng)箱（HF240型），購自HealForce 公司；倒置顯微鏡，奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖

健康細胞形成致密單層后，棄掉生長液，接種病毒并吸附1h，期間每隔15min晃動細胞瓶1次，保證病毒吸附均勻。加入與生長液等量，含2%新生牛血清的病毒維持液，期間不再換新的培養(yǎng)液。并同時設未接病毒的健康細胞2瓶做對照，置37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每日上、下午各觀察并記錄1次細胞病變情況，75%細胞出現(xiàn)病變時收獲，通過凍融釋放細胞內(nèi)病毒，置于-70℃冰柜保存?zhèn)溆?。此試驗連續(xù)重復3次測定病毒含量。

1.2.2 病毒含量測定

消化好的細胞計數(shù)后，均勻的加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液100μl，細胞形成單層后，將各試驗組收獲的待測病毒液，用病毒稀釋液分別進行10-1～10-8倍梯度系列稀釋，每稀釋度做6個重復孔，不同稀釋度的病毒液加入100μl/孔，健康細胞對照孔加100μl稀釋液，培養(yǎng)板四周不用于接種稀釋病毒液，避免邊緣效應產(chǎn)生。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，逐日用倒置顯微鏡觀察到120h，并記錄細胞病變出現(xiàn)孔，按Reed- Muench法計算病毒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 病變情況

PRVR株按一定比例接種5種細胞，病變達到75%時停止培養(yǎng)。接種ST細胞后20h細胞出現(xiàn)散在灶狀細胞圓縮，隨后病變細胞逐漸向周邊擴展，30h左后收獲；PRVR株接種PK15細胞后24h開始出現(xiàn)病變，40h左后收獲。PRVR株接種BHK21細胞后30h開始出現(xiàn)病變，38h左后收獲。PRVR株接種RK13細胞后13h開始出現(xiàn)病變，20h左后即可收獲。PRVR株接種雞胚成纖維細胞后30h開始出現(xiàn)病變，50h后收獲。對照組細胞均未出現(xiàn)細胞病變。

2.2 病毒含量的測定結(jié)果（見表1）

表1 PRVR株在不同種細胞上增殖的病毒含量

3 討論與結(jié)論

PRV可在多種動物細胞上增殖，并導致細胞產(chǎn)生病變。本次試驗對比了ST、PK15、BHK21、RK13、雞胚成纖維原代細胞培養(yǎng)PRV，摸索出該病毒在此5種細胞上的增殖規(guī)律與病變特點，在原有收毒最佳時機的基礎上，通過與生產(chǎn)實際相結(jié)合，篩選出最佳的生產(chǎn)用細胞，對疫苗研發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)起著十分重要的支撐作用和經(jīng)濟價值。

本次試驗結(jié)果顯示，PRVR株在RK13細胞上出現(xiàn)病變時間最早，但病毒含量較低，收獲時間也不適合大規(guī)模生產(chǎn)，需要下班時間操作。ST細胞病毒含量最高，收獲時間也方便工人操作，降低生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模生產(chǎn)。其他3種細胞在病毒含量介于前二者之間，可作為研究和生產(chǎn)病毒的替代細胞。因此建議將ST細胞作為培養(yǎng)PRVR株病毒液的工作細胞，可滿足大規(guī)模病毒液的產(chǎn)能需求，也無需產(chǎn)生額外的加班。