張 晨，葉晨曦，熊二輝，武麗敏

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 311112)

土壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要問題之一，全世界約有1/5的農(nóng)田受高鹽堿化的影響[1].水稻對鹽脅迫較為敏感，特別是在幼苗期和生殖期，土壤鹽堿化通過滲透脅迫、離子平衡和離子毒害等方式嚴重阻礙水稻的生長和發(fā)育[2].鹽脅迫是一個復雜的過程，在植物體內(nèi)誘導一系列生理生化反應，如種子萌發(fā)受阻[3]、生長受到抑制、光合能力下降[4]、膜透性增加和生物量下降[5].活性氧是有氧呼吸的代謝產(chǎn)物，主要包括過氧化氫(H2O2)、超氧自由基(O2·-)等[6]，鹽脅迫下植物體內(nèi)活性氧平衡被打破，這些活性氧自由基對水稻植株的蛋白質、質膜、葉綠素及其他細胞組分造成損傷，而此時植物細胞會通過抗氧化防御機制嚴格控制細胞內(nèi)活性氧的濃度[7].一旦體內(nèi)負責清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶等酶活力下降，則會引起活性氧的大量積累，導致膜脂過氧化、生物膜系統(tǒng)受損，進而對植物的光合作用、呼吸作用等造成影響，使其能耗增加，衰老加速，最終導致植株死亡[6,8].

為了闡明水稻耐鹽的遺傳機制，篩選耐鹽或鹽敏感水稻突變體、克隆其相關基因已經(jīng)成為挖掘水稻耐鹽新基因的有效策略[9].迄今，多個與水稻耐鹽性相關的QTL已被定位，但目前僅有少數(shù)耐鹽性相關QTL被克隆.已知的水稻耐鹽相關基因來自不同代謝途徑，在不同的組織器官中受鹽脅迫誘導差異表達[10].這些耐鹽相關基因可以分為：轉運蛋白編碼基因[11]、轉錄因子[12]、酶編碼基因[13]、MicroRNA編碼基因[14]以及其他功能蛋白編碼基因[15].其中，鈉離子轉運蛋白HKT在維持植物體內(nèi)K+、Na+平衡中起著重要作用，其過量表達可以提高植物的抗鹽性[10]；此外，在鹽脅迫下，MYB轉錄因子過量表達可提高植株對鹽脅迫的耐受性[16].

水稻對鹽脅迫的耐受性是受多種因素共同調控的，涉及生理、生化、細胞等多方面的響應[17]，這些因素之間的相互作用機理目前仍不清楚.本研究通過對水稻甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘變的突變體庫進行鹽脅迫處理，篩選獲得了1個水稻鹽敏感突變體，命名為ssm1(salt sensitive mutant 1),該突變體在鹽脅迫條件下葉片發(fā)生明顯卷曲，衰老加速、死亡，此外，ssm1還具有葉片早衰表型.通過高溫(45 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(20% PEG)和鹽(1% NaCl)脅迫處理，發(fā)現(xiàn)ssm1對鹽表現(xiàn)出專一敏感性.本研究通過鹽處理前后，ssm1突變體的體內(nèi)生理變化，探究SSM1參與水稻鹽脅迫耐受分子機理，為指導育種實踐提供重要的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究使用的水稻材料為蜀恢527(野生型，WT)和ssm1鹽敏感突變體.其中，ssm1是水稻品種蜀恢527經(jīng)EMS誘變處理獲得，經(jīng)連續(xù)多代自交，突變性狀遺傳穩(wěn)定.

種子浸種置于30 ℃恒溫箱，3～4 d后將發(fā)芽的水稻種子播種于人工氣候室中.人工氣候室的培養(yǎng)條件為：恒溫30 ℃，光照及黑暗時間分為14 h/10 h，光照強度為50～100 μmol·m-2·s-1.營養(yǎng)液母液配方見表1(使用過程中需要稀釋至1×使用).

表1 營養(yǎng)液母液配方Tab.1 Rice nutrient solution formula

1.2 實驗方法

1.2.1 脅迫處理

選取生長狀況良好兩周的水稻幼苗，分別于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行高溫脅迫處理48 h，4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理48 h，含20% PEG營養(yǎng)液中進行干旱處理24 h以及含1% NaCl營養(yǎng)液中進行鹽脅迫處理24 h，對比分析野生型和突變體生長狀態(tài)和生理指標差異.

1.2.2 H2O2含量分析(DAB染色)

利用DAB染色分析1% NaCl處理前后WT和ssm1突變體葉片中H2O2含量.染色液配制：取50 mg的DAB，加入45 mL的水，攪拌均勻使之完全溶解，然后用0.2 M的鹽酸調節(jié)pH至3.0后，加入25 μL的吐溫20，再加入2.5 mL 0.2 M的Na2HPO4，攪拌均勻，加H2O至50 mL.鹽脅迫處理前后的新鮮葉片完全浸沒于DAB染色液中，真空泵中緩慢抽真空，2次，每次5 min，避光染色12 h后置于脫色液(V乙醇∶V乙酸∶V甘油= 3∶3∶1)中脫色.

1.2.3 MDA和T-AOC測定

水稻生長至四葉期后，選取生長狀況良好且均一的水稻W(wǎng)T和ssm1突變體置于含1% NaCl的營養(yǎng)液中處理 0、1、24 h，取新鮮葉片用于丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)測定，試劑盒購買于Solarbio生物技術公司(BC0025 和 BC1310).T-AOC測定原理：在酸性環(huán)境下，還原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了總抗氧化能力.我們利用分光光度計測定Fe2+-TPTZ 的顏色吸光度大小來反映總抗氧化能力的多少.取0.1 g新鮮葉片置于1 mL磷酸緩沖液(50 μmol/L,pH 7.0)中研磨成勻漿，8 000 g 離心10 min，上清在波長593 nm下測定T-AOC的吸光度，在波長532 nm 和600 nm下測定MDA的吸光度.

1.2.4 耐鹽相關基因表達量測定

取鹽處理 0、1、6 h 野生型和ssm1突變體水稻葉片樣品各 0.1 g，液氮迅速冷凍置于-80 ℃冰箱，保存?zhèn)溆?采用 Trizol 法(康為世紀)提取水稻總RNA，NanoDropTM2000測定濃度，利用反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMII1st Strand cDNASythesis Kit(Takara)進行反轉錄.選取耐鹽相關基因OsHKT1;1和OsMYB2，通過實時熒光定量PCR檢測鹽處理前后WT和ssm1中相對表達量.分別以WT和ssm1的cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參，反應體系(10 μL)∶cDNA template 1 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 3 μL，3個重復，在熒光定量PCR儀(Bio Rad CFX96)上反應，反應程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán).

表達量計算公式：

ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test),

ΔCT(calibrator)=CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator),

ΔΔCT=ΔCT(test)-ΔCT(calibrator), 2-ΔΔCT=表達量比值.

引物見表2.

表2 相關基因引物Tab.2 Related primers in this study

2 結果與分析

2.1 ssm1突變體篩選

利用EMS處理野生型水稻，我們共獲得了含5 000份材料的水稻突變體庫.通過對該突變體庫進行鹽脅迫處理，獲得了多個鹽耐受性改變的材料，其中一個命名為ssm1.研究發(fā)現(xiàn)，在1%鹽濃度脅迫處理后，突變體ssm1幾乎全部枯黃致死，而野生型只有部分葉片枯黃(圖1b).ssm1突變體存活率不足6%，而野生型植株存活率為92%.上述結果表明，與野生型相比，ssm1突變體對鹽脅迫敏感.

a:野生型和ssm1突變體2周苗表型; b:野生型和ssm1突變體1% NaCl脅迫處理10 d后表型;c:統(tǒng)計分析鹽脅迫處理10 d后野生型和ssm1突變體存活率.Bar=2 cm.

2.2 ssm1突變體表型分析

進一步研究發(fā)現(xiàn)，在四葉期時ssm1突變體葉片表現(xiàn)出黃色條斑表型(圖2a和b)，并持續(xù)至整個生命周期(圖2c和d)；而且伴隨葉片衰老，植株也出現(xiàn)株高變矮表型(圖2c).說明ssm1不僅參與植物鹽脅迫調控和葉片衰老，同時影響植株的生長發(fā)育.

a:WT和ssm1四葉期表型; b:WT和ssm1四葉期葉片表型; c:WT和ssm1分蘗期植株表型;d:WT和ssm1分蘗期葉片表型.

2.3 鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中H2O2積累

圖3 鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中H2O2積累Fig.3 Salt stress affects H2O2 accumulation in ssm1 mutant leaves

脅迫能引起水稻活性氧的積累，造成水稻植株氧化損傷，影響植株正常的生長和發(fā)育，甚至導致植株死亡[20].DAB染色是一種簡單有效的定性測定H2O2含量的方法，已被廣泛應用于水稻[21]和小麥[22]等農(nóng)作物研究.為探尋ssm1突變體在鹽脅迫條件下葉片中H2O2積累的情況，我們對鹽處理不同時期的野生型和ssm1突變體葉片進行了DAB染色分析.結果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理前突變體中H2O2含量高于野生型(圖3a).此外，盡管鹽脅迫處理后均引起野生型和突變體葉片中H2O2積累，但是在ssm1突變體中H2O2的積累量顯著高于野生型(圖3b、c和d).說明鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中H2O2的積累.

2.4 鹽脅迫影響ssm1突變體MDA積累和總抗氧化能力

MDA是植物細胞膜質過氧化程度的重要指標之一，較高的MDA含量說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到傷害，同時也降低了植物的耐鹽性[23].因此我們對鹽處理前后葉片中的MDA含量進行了測定(圖4a).結果顯示，無論是鹽處理前后(0和24 h)，ssm1葉片中MDA積累量以及上升速率顯著高于野生型，說明ssm1葉片中細胞膜質過氧化程度高于野生型，且隨著鹽脅迫時間的增加而加劇，該結果與鹽脅迫處理后ssm1突變體中H2O2含量顯著高于野生型的結果相符.此外，對鹽處理前后水稻葉片中總抗氧化能力測定(圖4b)發(fā)現(xiàn)，鹽處理24 h后野生型和突變體總抗氧化能力均低于處理前，無論是鹽脅迫處理前還是鹽處理后野生型總抗氧化能力均顯著高于ssm1突變體，推測鹽脅迫處理前期由于植株應激反應引起植株總抗氧化能力的提高，但隨著脅迫程度的加深總抗氧化能力隨之降低[7].

a:WT和ssm1突變體MDA的含量; b:WT和ssm1突變體T-AOC.

2.5 鹽脅迫影響ssm1葉片中耐鹽相關基因的表達

為探究鹽脅迫對ssm1葉片中耐鹽相關基因表達量的影響，利用qRT-PCR對鹽脅迫前后野生型和ssm1突變體葉片中OsMYB2和OsHKT;1的表達量進行了檢測.結果顯示，在鹽脅迫處理前，ssm1突變體葉片中OsMYB2和OsHKT;1的表達量均顯著高于野生型，由此可以推測，與野生型相比，水稻ssm1突變體在鹽脅迫處理前可能就處于一種脅迫狀態(tài).鹽處理1 h后這兩個基因在野生型和ssm1突變體中的表達量均上調，但此時ssm1中的表達量卻低于野生型，尤其是OsMYB2在ssm1中的表達量，僅為野生型的1/2.隨著鹽脅迫處理時間的增加(6 h)，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和ssm1水稻突變體中的表達量下調，此時OsHKT;1在ssm1突變體中的表達量為野生型的2/3，OsMYB2在ssm1突變體中的表達量已不足野生型的1/20(圖5).這些耐鹽基因表達模式的改變，可能是ssm1突變體對鹽敏感的主要原因.

圖5 鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中耐鹽相關基因的表達Fig.5 Salt stress affects the relative expression of salt tolerance related-genes in ssm1 mutant leaves

3 討論

植物在正常的生長條件下，體內(nèi)酶和非酶系統(tǒng)使活性氧的產(chǎn)生和清除維持在一個動態(tài)平衡之中，然而，在鹽脅迫下，這種動態(tài)平衡被打破，體內(nèi)的活性氧迅速產(chǎn)生并積累，對植物的生長產(chǎn)生強烈的破壞作用[24].本研究通過對EMS誘變的種庫進行鹽敏感性材料篩選獲得了一個鹽敏感突變體ssm1.此外，進一步研究發(fā)現(xiàn)ssm1突變體具有早衰表型(圖2)，因此SSM1不僅參與鹽脅迫調控，且調控植株的生長發(fā)育.

DAB染色是定性檢測過氧化氫含量的有效手段之一[25]，對鹽脅迫處理前后的野生型和突變體葉片進行DAB染色，結果顯示鹽脅迫處理后突變體中過氧化氫積累量以及積累速率顯著高于野生型(圖3)，過高的過氧化氫積累可能是引起突變體對鹽脅迫敏感的原因之一.MDA含量和總抗氧化能力檢測結果表明，鹽脅迫處理后突變體葉片中MDA的含量顯著高于野生型(圖4)，且此時突變體的總抗氧化能力也顯著低于野生型(圖4)，該結果與H2O2的結果相符(圖3).以往研究表明，植物體內(nèi)積累的過氧化氫和MDA可能是由于抗氧化物酶系統(tǒng)紊亂引起的[26].在水稻ssm1突變體中抗氧化物酶活性的紊亂導致植株積累大量的過氧化氫和MDA，活性氧的積累引起膜脂質氧化程度高，導致膜透性改變、抗氧化能力下降，促使植物細胞死亡.

植物對鹽脅迫的應答過程中發(fā)生的一系列生理生化變化，是復雜的內(nèi)在分子機制調控的結果.水稻中存在許多鹽脅迫相關的基因，如MYB2[16]、SOS1[27]、SOS2[27]和HKT1[28]，這些基因在鹽脅迫條件下起著重要作用.OsMYB2是MYB基因家族中編碼R2R3型MYB轉錄因子的基因[16]，該轉錄因子在水稻響應鹽脅迫的過程中起重要的調節(jié)作用[26]；OsHKT;1是HKT基因家族水稻OsHKT;1鈉轉運體的基因，該鈉轉運體參與提高水稻耐鹽性[10].在鹽脅迫處理前，OsMYB2和OsHKT;1在突變體中的表達量略高于野生型，這可能是由于突變體已處于脅迫狀態(tài)，OsMYB2和OsHKT;1基因上調表達參與脅迫調控.隨著處理時間的增加，在鹽脅迫處理時間2 h左右，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和突變體中的相對表達量比處理0 h時均有所上升，說明鹽脅迫處理后，野生型和突變體中OsMYB2和OsHKT;1均上調表達參與鹽脅迫響應，然而野生型增長速率顯著高于ssm1突變體，且野生型的表達量略高于突變體，說明突變體在鹽處理條件下的脅迫響應能力低于野生型.然而隨著鹽脅迫處理時間的增加(6 h)，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和ssm1水稻突變體中的表達量均下調且突變體中的表達量顯著低于野生型.由此可以推測，與野生型相比，突變體中鈉轉運體表達量的降低可能引起大量Na+進入細胞，耐鹽相關基因的下調表達可能是引起植株鹽耐受性下降的重要原因.

綜上所述，SSM1基因的突變，導致在鹽脅迫條件下，ssm1突變中過氧化氫和MDA大量積累，活性氧的積累進而引起膜透性改變、植株抗氧化能力降低，并造成鈉轉運體基因表達量下調，外源的Na+大量進入細胞，導致細胞死亡.