宋敬怡 張碩峰 馬丹 程龍 程文豪 李穎慧

烏頭自古是中醫(yī)治療痹證的經(jīng)典用藥，其性熱、味苦、有大毒?！督饏T要略》中明確指出烏頭可祛除濕寒、溫經(jīng)通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理證明，烏頭具有抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)心血管、抗癌等作用，臨床試驗(yàn)表明烏頭可使患者的疼痛指數(shù)降低，功能障礙改善明顯[1-3]。

痹癥的患病主要外因是機(jī)體受到風(fēng)、寒、濕、熱等外邪入侵，痹證常見(jiàn)的臨床癥狀就是疼痛[4]。痹證引起的疼痛屬于病理性疼痛，具體表現(xiàn)為痛覺(jué)敏感，其中神經(jīng)元可塑性改變引起中樞敏化是慢性炎性疼痛產(chǎn)生的重要機(jī)制[5]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)之上，利用風(fēng)寒濕和風(fēng)熱濕兩種致病因素疊加佐劑型關(guān)節(jié)炎復(fù)制寒痹證、熱痹證模型，企圖進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)痛覺(jué)敏感的相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)痹證寒、熱演變規(guī)律，同時(shí)了解溫?zé)崴帪躅^對(duì)寒、熱痹證的作用差異，這將對(duì)中醫(yī)的證候研究、中藥的藥性理論研究具有廣泛的示范意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠100只，SPF級(jí)，周齡：8周左右，雄性，體重200～250 g，(購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：11401500032878，11401500032657)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

布洛芬緩釋膠囊(中美天津史克制藥有限公司)，規(guī)格0.4 g/片，即0.8 g布洛芬/人/日(按藥典內(nèi)容計(jì)算)，按成人體重75 kg計(jì)算，即0.01 g布洛芬/kg，大鼠受試劑量為臨床人用量的6倍，即0.06 g/kg，按大鼠體重1 mL/100 g給藥。

川烏頭(生藥材，由北京百諾威生物科技公司提供)，臨床用量為每人每天10 g生藥(按藥典內(nèi)容計(jì)算)，按成人體重75 kg計(jì)算，即0.13 g/kg，大鼠受試劑量分別為臨床用量的12、6倍，即1.6 g/kg、0.8 g /kg。將烏頭水提物稀釋，濃度分別為 0.16 g /mL、0.08 g /mL。按大鼠體重1 mL/100 g給藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

冷熱盤測(cè)痛儀(Cat. No：PE34， 美國(guó)IITC公司產(chǎn)品)。

1.4 分組與造模

大鼠100只，隨機(jī)分為9組，組別如下：對(duì)照組，模型組，布洛芬組，熱痹證組，寒痹證組，烏頭熱痹1.6 g、0.8 g/kg組，烏頭寒痹1.6 g、0.8 g /kg組。

操作環(huán)境為無(wú)菌條件，在大鼠右后足跖部按0.1 mL/只注射完全弗氏佐劑建立大鼠佐劑型炎癥模型。24 h后按寒熱屬性將需要造模的大鼠分別放入相應(yīng)的恒溫人工氣候箱中，造模時(shí)長(zhǎng)為4 h/日，造模周期為14天。熱痹造模條件為：溫度30℃，濕度60%，風(fēng)速1.5 m/s；寒痹造模條件為：溫度10℃，濕度70%，風(fēng)速1.5 m/s。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 痛反應(yīng)時(shí)間的檢測(cè) 檢測(cè)時(shí)間分別為第0天(基礎(chǔ)值)、第3天、7天、10天、14天，觀察部位為大鼠的右后肢足趾部。具體測(cè)量方法見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)[6]，每只大鼠的測(cè)量次數(shù)總共為3次，每次測(cè)量距離上次測(cè)量的時(shí)間以超過(guò)10 min為宜， 痛反應(yīng)時(shí)間則是3次測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值。

1.5.2 Western Blot法測(cè)量相關(guān)蛋白 選取每組半數(shù)大鼠用于Western Blot法測(cè)量，于末次給藥后禁食12 h，腹腔注射1.5 %戊巴比妥鈉，待大鼠深度麻醉后，開(kāi)胸使其心臟暴露，由主動(dòng)脈灌入生理鹽水約200 mL左右，直至流出液體變?yōu)榈凵驘o(wú)色為止，此時(shí)肝臟顏色呈現(xiàn)為土黃色。取出L4～6脊髓節(jié)段通過(guò)蛋白樣品制備后得到蛋白樣品，通過(guò)Western Blot法測(cè)量FKN、CX3CR1、NMDA受體表達(dá)，分析結(jié)果保存圖片。

1.5.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)量相關(guān)蛋白 選取每組半數(shù)大鼠用于免疫組織化學(xué)法測(cè)量，末次給藥禁食12h后，深度麻醉取出被根神經(jīng)節(jié)制作成石蠟切片，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)相關(guān)因子的表達(dá)，觀察圖片結(jié)果。選取各組背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本數(shù)量為9張，每張選取3個(gè)視野，于顯微鏡400 倍的視野中觀察，測(cè)量各組別背根神經(jīng)節(jié)區(qū)域中陽(yáng)性顯色的平均光密度(average optical density，AOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠痛反應(yīng)時(shí)間的影響

結(jié)果表明，模型組大鼠與對(duì)照組相比較， 各時(shí)間點(diǎn)的痛反應(yīng)時(shí)間均明顯縮短(P<0.05)。布洛芬有鎮(zhèn)痛功效，給藥后，與模型組相比較，布洛芬組大鼠的痛反應(yīng)時(shí)間明顯上調(diào)(P<0.05)。風(fēng)寒濕因素引入后，與模型組相比較，前期可抑制寒痹證組大鼠患足對(duì)溫度的敏感性，其中第3、7 天結(jié)果最為明顯(P<0.05)。風(fēng)熱濕因素引入后，與模型組相比較，熱痹證組大鼠的痛反應(yīng)時(shí)間在第3天延長(zhǎng)明顯(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異。

與熱痹證組相比較，寒痹證組大鼠的痛反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)明顯，在第7、10天的結(jié)果尤為顯著(P<0.05)。相比熱痹證組，烏頭熱痹證各劑量組給藥后痛反應(yīng)時(shí)間均不同程度縮短，其中第3、7、10天烏頭熱痹證高劑量組作用最為明顯(P<0.05)。相比寒痹證組，烏頭寒痹證各劑量組給藥后，表現(xiàn)為大鼠患足的痛反應(yīng)時(shí)間得到不同程度的延長(zhǎng)，其中烏頭寒痹證高劑量組痛反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)作用最明顯(P<0.05)，同劑量烏頭寒、熱痹證組相比較，在給藥第7天， 烏頭寒痹證組的痛反應(yīng)時(shí)間顯著性高于同劑量烏頭熱痹證組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠痛反應(yīng)時(shí)間的影響

2.2 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠脊髓中FKN、CX3CR1、NMDAR表達(dá)的影響

關(guān)于FKN結(jié)果顯示，造模后，模型組大鼠脊髓中FKN的表達(dá)高于對(duì)照組,結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05)，布洛芬組FKN的表達(dá)顯著性低于模型大組(P<0.05)。與模型組相比較，寒、熱痹證組大鼠脊髓中FKN蛋白表達(dá)顯著性增加(P<0.05)。與寒痹證組相比較，烏頭給藥后，寒痹證組有明顯抑制作用，F(xiàn)KN蛋白表達(dá)明顯下降，高劑量效果最為明顯(P<0.05)。熱痹證組的結(jié)果正好相反，其中烏頭熱痹證高劑量組脊髓的FKN表達(dá)最高(P<0.05)，同劑量組相比較，顯著性高于同劑量寒痹證組(P<0.05)，CX3CR1、NMDAR的結(jié)果與FKN的結(jié)果基本呈現(xiàn)一致性，見(jiàn)表2、圖1、圖2、圖3。

表2 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠脊髓FKN、CX3CR1、NMDAR表達(dá)的影響

注：A-對(duì)照組，B-模型組，C-布洛芬組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹證0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組。

圖1 烏頭對(duì)寒、熱痹模型大鼠脊髓中FKN表達(dá)的影響

注：A-對(duì)照組，B-模型組，C-布洛芬組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹證0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組。

圖2 烏頭對(duì)寒、熱痹模型大鼠脊髓中CX3CR1表達(dá)的影響

注：A-對(duì)照組，B-模型組，C-布洛芬組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹證0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組。

圖3 烏頭對(duì)寒、熱痹模型大鼠脊髓中NMDAR表達(dá)的影響

2.3 烏頭對(duì)寒、熱痹證模型大鼠患側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中FKN、CX3CR1、CD11b/c、NMDAR表達(dá)的影響

結(jié)果表明，顯微鏡下，棕黃色顆粒即為FKN、CX3CR1、CD11b/c、NMDAR陽(yáng)性表達(dá)部位，400倍物鏡下拍照，之后用IPP6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。造模后，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中FKN的表達(dá)上調(diào)，顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)。與模型組比較，布洛芬可明顯抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)中FKN的表達(dá)(P<0.05)。風(fēng)寒濕、風(fēng)熱濕熱因素的引入后，與模型組相比，寒痹證組、熱痹證組背根神經(jīng)節(jié)中FKN的表達(dá)均明顯上升(P<0.05)。與寒痹證組比較，烏頭給藥2周后，發(fā)現(xiàn)各劑量可明顯下調(diào)寒痹證組FKN的表達(dá)(P<0.05)。與熱痹證組比較，烏頭熱痹證各劑量組的結(jié)果相反，F(xiàn)KN的表達(dá)程明顯上升趨勢(shì)，且劑量越大越明顯(P<0.05)，且顯著性高于同劑量寒痹證組(P<0.05)，CX3CR1、CD11b/c、NMDAR的表達(dá)結(jié)果與FKN的表達(dá)結(jié)果呈現(xiàn)出一致性，見(jiàn)表3、圖4、圖5、圖6、圖7。

表3 烏頭對(duì)寒、熱痹模型大鼠患側(cè)背根神經(jīng)節(jié)FKN、CX3CR1表達(dá)的影響

注：A-對(duì)照組，B-布洛芬組，C-模型組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹證0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組。

圖4 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠背根神經(jīng)節(jié)FKN表達(dá)的影響(免疫組化法400×)

注：A-對(duì)照組，B-布洛芬組，C-模型組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹證0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組

圖5 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠背根神經(jīng)節(jié)CX3CR1表達(dá)的影響(免疫組化法400×)

注：A-對(duì)照組，B-布洛芬組，C-模型組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹證0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組。

圖6 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠背根神經(jīng)節(jié)CD11b/c表達(dá)的影響(免疫組化法400×)

注：A-對(duì)照組，B-布洛芬組，C-模型組，D-熱痹證組，E-寒痹證組，F(xiàn)-烏頭熱痹0.8 g/kg劑量組，G-烏頭熱痹證1.6 g/kg劑量組，H-烏頭寒痹證0.8 g/kg劑量組，I-烏頭寒痹證1.6 g/kg劑量組。

圖7 烏頭對(duì)寒、熱痹證大鼠背根神經(jīng)節(jié)NMDAR表達(dá)的影響(免疫組化法400×)

3 討論

烏頭屬毛茛科植物，其藥用資源十分豐富，主要產(chǎn)地為四川、陜西，據(jù)統(tǒng)計(jì)可入藥的烏頭種類多達(dá)70余種[7-8]。烏頭的功效主要為祛風(fēng)除濕和溫經(jīng)散寒，是治療風(fēng)寒濕痹的代表藥，現(xiàn)在主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、中風(fēng)以及寒涼引起的臟腑之痛等[9]。中國(guó)使用烏頭最早的記錄為《金匱要略》中的烏頭湯。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，烏頭最主要的抗炎、鎮(zhèn)痛成分為二萜生物堿，是在19世紀(jì)80年代從烏頭屬植物中分離得到的，鎮(zhèn)痛的主要部位為脊髓和背根神經(jīng)節(jié)，可改善神經(jīng)病理性疼痛引起的痛覺(jué)過(guò)敏[10-14]。

痹證引發(fā)的疼痛屬于神經(jīng)病理性疼痛，其主要發(fā)生機(jī)制則是中樞敏化。中樞敏化的產(chǎn)生會(huì)將疼痛信號(hào)放大，使機(jī)體對(duì)非傷害刺激或正常范圍內(nèi)的傷害刺激敏感化。大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎常被用作研究痹證的動(dòng)物模型，其病理特征與中醫(yī)痹證呈現(xiàn)高度的一致性，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛敏感?，F(xiàn)代研究表明痹證所造成的長(zhǎng)期炎癥可造成關(guān)節(jié)損傷，但其寒熱屬性并不明顯，因此對(duì)鎮(zhèn)痛除痹的相關(guān)中藥的藥理作用研究存在局限性[15]。故在前期研究的基礎(chǔ)之上，利用佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，引入風(fēng)寒濕和風(fēng)熱濕因素制作寒、熱痹證模型，觀察相關(guān)指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示正常大鼠的右足跖部在注射完全弗氏佐劑后，第3天后模型組大鼠就表現(xiàn)出痛覺(jué)敏感，與對(duì)照組相比，痛反應(yīng)時(shí)間明顯縮短，此現(xiàn)象保持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.05)。風(fēng)寒濕加入后，開(kāi)始可抑制寒痹證組大鼠患足對(duì)溫度刺激的敏感性，隨著時(shí)間的推移，風(fēng)寒濕可加劇寒痹模型組大鼠的痛覺(jué)敏感，而風(fēng)熱濕對(duì)熱痹模型組的溫度閾值影響反應(yīng)小，具體表現(xiàn)為熱痹證組的痛反應(yīng)時(shí)間與模型組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究對(duì)寒、熱痹證模型大鼠均給予高、中劑量的烏頭水提物，主要目的是區(qū)分熱性中藥對(duì)寒、熱痹證大鼠痛覺(jué)敏感的干預(yù)作用的不同之處。結(jié)果顯示，與寒痹證組相比，連續(xù)14天給予烏頭水提物，寒痹證組大鼠的痛反應(yīng)時(shí)間得到明顯上調(diào)(P<0.05)；而熱痹證組給藥后，均加重了熱痹證組大鼠對(duì)溫度刺激的敏感性，其中烏頭熱痹1.6 g/kg劑量組最為明顯。由此說(shuō)明烏頭對(duì)寒痹證組大鼠的痛覺(jué)敏感有抑制作用，而對(duì)熱痹證組大鼠的作用相反。提示：佐劑型關(guān)節(jié)炎模型大鼠疊加風(fēng)寒濕、風(fēng)熱濕制作寒痹證組、熱痹證組與中醫(yī)寒、熱痹證的證候特點(diǎn)一致。

前期研究證明，可初級(jí)傳入谷氨酸的C纖維以及谷氨酸受體陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布在脊髓背角淺層，其中在神經(jīng)病理疼痛形成過(guò)程與N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)功能變化密不可分。原因是NMDAR可整合并傳遞相關(guān)疼痛信息，參與脊髓神經(jīng)元的可塑性變化。正常情況下，NMDAR處于靜息狀態(tài)，Mg2+與內(nèi)通道相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合阻止Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)機(jī)體受到傷害時(shí)，興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)在脊髓后角釋放后導(dǎo)致NMDAR被磷酸化，此時(shí)NMDAR處于興奮狀態(tài)，解除了Mg2+與內(nèi)通道對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的結(jié)合，Ca2+大量?jī)?nèi)流進(jìn)入背角神經(jīng)元細(xì)胞，誘導(dǎo)持續(xù)性放電，并可使興奮不斷循環(huán)，疼痛信號(hào)持續(xù)放大。由此可見(jiàn)神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與NMDAR的激活以及Ca2+內(nèi)流關(guān)系密切，對(duì)脊髓背角神經(jīng)元的可塑性有重要的意義，是中樞敏化產(chǎn)生的關(guān)鍵[16-19]。

大量研究證明神經(jīng)病理性疼痛的刺激，可將脊髓水平的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活，其中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在痛覺(jué)敏感機(jī)制調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可將通過(guò)神經(jīng)元細(xì)胞傳入的傷害性信息整合，釋放對(duì)應(yīng)的炎性因子。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)寒痹證組、熱痹證組大鼠患側(cè)脊髓和背根神經(jīng)節(jié)的不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN)與CX3CR1受體表達(dá)上調(diào)。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)痛覺(jué)敏感時(shí)，F(xiàn)KN在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)均上升， CX3CR1作為FKN的特異性受體，其表達(dá)結(jié)果與FKN有著高度的一致性，最終可導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附性增加。炎癥反應(yīng)會(huì)使FKN/CX3CR1系統(tǒng)激活，此時(shí)與細(xì)胞膜結(jié)合的FKN脫離細(xì)胞膜，成為游離型FKN，與膠質(zhì)細(xì)胞中的CX3CR1受體結(jié)合，此時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)被激活的狀態(tài)[20-21]，中樞敏化因此產(chǎn)生。

結(jié)果顯示，造模后，相比對(duì)照組，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致模型組大鼠脊髓、背根神經(jīng)節(jié)中NMDAR的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。風(fēng)寒濕和濕熱因素加入后，與模型組相比，加重了寒、熱痹證組大鼠脊髓中NMDAR的表達(dá)(P<0.05)，而寒痹證組與熱痹證組相比，熱痹證組更嚴(yán)重(P<0.05)。以上結(jié)果顯示各模型組大鼠痛覺(jué)敏感均已經(jīng)形成，且風(fēng)寒濕和風(fēng)熱濕會(huì)加重寒、熱痹證大鼠的痛覺(jué)敏感，其中NMDAR在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)上升趨勢(shì)與熱痹疼痛的關(guān)聯(lián)更緊密。與寒痹證組相比，烏頭水提物給藥14天后， NMDAR在寒痹證組當(dāng)中的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，在熱痹證組表達(dá)與之相反(與熱痹證組相比，P<0.05)。綜上所述，NMDAR在烏頭各劑量組大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)與其烏頭給藥組大鼠痛反應(yīng)時(shí)間的影響結(jié)果一致。

CD11b/c、FKN、CX3CR1的檢測(cè)結(jié)果與NMDAR檢測(cè)結(jié)果相似，上述結(jié)果顯示，加入風(fēng)寒濕和風(fēng)熱濕會(huì)加劇寒、熱痹證大鼠痛覺(jué)敏感。溫?zé)崴帪躅^對(duì)寒、熱痹證的干預(yù)作用存在差異，首先烏頭對(duì)寒痹證具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但可加重?zé)岜宰C的疼痛程度。烏頭的這種干預(yù)作用與其調(diào)節(jié)大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中FKN、CX3CR1、CD11b/c、NMDAR的表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)論以期為痹證后續(xù)的相關(guān)研究提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。