成 熙，黃月英，李 奕 （海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院：. 虹口院區(qū)呼吸科, . 虹口院區(qū)藥學(xué)科，上海 200081）

在我國(guó)，肺炎鏈球菌是引起中國(guó)嬰幼兒和老年人發(fā)病和死亡的重要病因，是社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP)、菌血癥、兒童化膿性腦膜炎的常見(jiàn)病原菌[1]。2012 年亞太地區(qū)病原體耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)顯示，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.p)在亞洲地區(qū)總體多重耐藥比例為59.3%，而在中國(guó)的多重耐藥比例高達(dá)83.3%[2]，且部分地區(qū)肺炎鏈球菌耐藥率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[3-4]。

莫西沙星屬第四代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，抗菌譜廣，對(duì)常見(jiàn)呼吸道病菌特別是肺炎鏈球菌抗菌作用強(qiáng)大，2016 年中國(guó)成人CAP 診治指南推薦可選擇莫西沙星等喹諾酮類(lèi)藥物作為初始經(jīng)驗(yàn)性抗感染藥物[5]。莫西沙星所有適應(yīng)證口服給藥的常規(guī)劑量均為400 mg/d。隨著莫西沙星上市以來(lái)臨床研究的深入，不良反應(yīng)事件也有所增加[6]。本研究采用微透析方法獲取肺炎大鼠肺組織間液中的游離藥物濃度，旨在模擬莫西沙星在感染患者靶器官中的藥動(dòng)學(xué)變化，探究正常與感染狀態(tài)下的靶器官藥物分布的差異，分析鏈球菌感染狀態(tài)下莫西沙星體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取Wistar 大鼠24 只，雄性，SPF 級(jí)，4～6 周齡，其體質(zhì)量為200～220g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)：2 007 000 514 232）。隨機(jī)分為健康組及肺炎組各12 只，兩組大鼠體質(zhì)量分別為（210.92±5.95）g 和（208.58±5.33）g，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)前各組大鼠禁食12 h 過(guò)夜，動(dòng)物飼養(yǎng)遵從中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用協(xié)議。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

CMA402 型微量泵、CMA820 型微量收集器、血管探針、肺探針（瑞典 CMA 公司）；ALC-V8S 小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；安捷倫1 100 高效液相色譜儀，配有Chemstation 工作站；XW-80 型渦旋混合器（其林貝爾）；Thermo LEGEND Micro 17 高速離心機(jī)（賽默飛）；METTLER AE240 電子天平（梅特勒）。莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度＞99%，批號(hào)1 448 606），莫西沙星片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ13520）；甲醇（HPLC 級(jí)，Burdick & Jackson 公司），乙腈（HPLC 級(jí)，Merck 公司），甲酸（Fluka 公司，瑞士）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

肺炎鏈球菌由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，于接種前1 d 接種于血瓊脂平板，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成含細(xì)菌濃度為0.6×108cfu/ml 的混懸液，備用。質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC49619上海寶米科生物科技有限公司提供）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物處理

造模：采用氣管穿刺法注入菌液建立肺炎大鼠模型。腹腔麻醉后，切開(kāi)頸部皮膚暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間穿刺，注入肺炎鏈球菌混懸液 0.2 ml（約0.12×108cfu/只），將大鼠直立位20 s，再使大鼠保持右側(cè)臥位10 min，促使菌液充分流入右肺。于接種后第5～7 天建立大鼠右側(cè)肺炎模型。所有大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行病理解剖及肺組織勻漿培養(yǎng)證實(shí)建模成功。

1.4.2 探針植入

取造模成功的肺炎大鼠麻醉后，固定于保溫墊，在氣管上段做一T 型切口，插入氣管導(dǎo)管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，頻率75～80 次/min，潮氣量2.5 ml。于大鼠右側(cè)胸壁做斜行切口，止血鉗離斷第5 肋骨前肋，充分暴露右肺。用注射器針尖稍刺破右肺中葉臟層胸膜，將肺探針向肺門(mén)方向鈍性植入肺組織，復(fù)位肺葉，固定探針并關(guān)閉胸腔。切開(kāi)左側(cè)股靜脈，植入血管探針推送至下腔靜脈固定。

1.5 莫西沙星藥動(dòng)學(xué)分析

1.5.1 給藥及樣本收集

取莫西沙星1 片，刮去包衣后磨成細(xì)粉末狀，加入0.5%羧甲基纖維素鈉無(wú)菌注射用水溶解，制成混懸溶液，濃度為10 mg/ml。

兩組大鼠分別通過(guò)灌胃給藥的方式注入莫西沙星混懸液，給藥劑量按4 ml/kg 計(jì)算，5 s 內(nèi)注入完畢，立即開(kāi)始收集血漿及肺組織透析樣品。采用HPLC 法分別測(cè)定前5 h 的莫西沙星濃度。1.5.2 HPLC 法測(cè)定透析液中莫西沙星含量

(1)色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相：乙腈: 0.1%甲酸水（25:75，V/V）；流速：1.0 ml/min，分析時(shí)間10 min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：5 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)295 nm。

(2)透析液處理 精密量取100 μl 透析液樣品，置1.5 ml 塑料離心管中，加入200 μl 甲醇，漩渦混合30 s 后，12 000 r/min 離心10 min，取200 μl 上清液于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣5 μl 進(jìn)行HPLC 分析。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍 取空白透析液100 μl，精密加入莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液20 μl 旋渦混勻，配成莫西沙星濃度分別為5.00、2.00、1.00、0.50、0.20、0.10 及0.05 μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)含藥肺透析液，除不加200μl 醇外，其余按“透析液樣品處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算莫西沙星峰面積。莫西沙星以肺透析液中待測(cè)物濃度(X)為橫坐標(biāo)，莫西沙星峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：

結(jié)果表明莫西沙星在0.05～5.00 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.5.3 定量限與檢測(cè)限

配制莫西沙星濃度為0.05 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)含藥透析液5 份，進(jìn)行分析，依照當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程求得 實(shí) 測(cè) 濃 度 為（0.051 ± 0.004）μg/ml，準(zhǔn) 確 度90.8%～116.66%。結(jié)果表明莫西沙星在血漿中的定量下限為0.05 μg/ml，S/N＞10，線(xiàn)性關(guān)系良好。經(jīng)逐級(jí)稀釋?zhuān)碨/N＞3 測(cè)得莫西沙星在血漿中的檢測(cè)限為0.015 μg/ml。

1.5.4 精密度試驗(yàn)

制備含莫西沙星的濃度分別為0.05、0.50、5.00 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)含藥肺透析液（每個(gè)濃度做5 份），按“肺透析液樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，連續(xù)做3 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。測(cè)得日內(nèi)精密度RSD 分別為6.628 1%、2.624 7%、2.828 2%；日間精密度分別為2.379 3%、1.027 1%、2.422 1%，均小于10%，符合精密度要求。

1.5.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以相對(duì)回收率表示，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備”項(xiàng)下制備含有莫西沙星濃度分別為0.05、0.50、5.00 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥肺透析液，按“肺透析液樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算實(shí)測(cè)濃度與實(shí)際濃度的比值即為相對(duì)回收率。結(jié)果分別為105.21%、104.82%、106.45%，均在80%～120%范圍內(nèi)，且RSD＜10%，符合要求。

1.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

莫西沙星濃度分別為0.05、0.5、5.0 μg/ml 的肺透析液樣品各3 份，分別進(jìn)行室溫、4 ℃及凍融穩(wěn)定性考察，RSD 均＜10%。結(jié)果表明樣品在上述條件下保持穩(wěn)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用反向透析法測(cè)定探針回收率（Rdial），體內(nèi)實(shí)際藥物濃度（Cu）由所得透析液濃度（Cm）按公式計(jì)算，Cu=Cm/Rdial轉(zhuǎn)化獲得。采用Pksolver 2.0 軟件，以非房室模型計(jì)算以下藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)：曲線(xiàn)下面積（AUC）、平均滯留時(shí)間（MRT）、藥物消除半衰期（t1/2）、藥物峰濃度（Cmax）、藥物在肺部的穿透率（PR=C肺/C血液）、藥物的分布系數(shù)（AUC肺/AUC血液）。

采用SPSS 17.0 版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)先經(jīng)方差齊性分析，符合正態(tài)分布者，采用兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 正常大鼠和肺炎大鼠肺組織藥-時(shí)曲線(xiàn)

經(jīng)灌胃給予莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠肺組織藥物濃度迅速上升，約1 h 達(dá)峰，隨后兩者同步下降。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程肺炎大鼠肺組織濃度均高于正常大鼠，肺炎大鼠肺組織Cmax約為正常大鼠的3.4 倍。兩組大鼠肺組織中莫西沙星的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分布情況見(jiàn)圖1。

2.2 正常大鼠和肺炎大鼠血漿藥-時(shí)曲線(xiàn)

灌胃給予莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠血漿游離藥物濃度明顯上升，Cmax無(wú)明顯差異，兩組大鼠血漿中莫西沙星的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分布情況見(jiàn)圖2。

2.3 肺組織穿透率（PR）

計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)在肺組織中的穿透率(PR 值)，正常大鼠和肺炎大鼠肺組織穿透率最高分別為0.27 和1.87；最低分別為0.16 和0.89，平均值分別為0.18±0.10 和1.26±0.32(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

大鼠灌胃莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用非房室模型進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

正常大鼠及肺炎大鼠肺組織Cmax分別為（1.42±0.05）μg/ml、（4.84±0.02）μg/ml（P＜0.01），t1/2分別為（1.9±0.63）h、（3.39±0.79）h（P＞0.05），一階矩曲線(xiàn)下面積AUMC 分別為（11.93±5.14）μg/ml·h2、（107.01±25.39）μg/ml·h2（P＜0.05），AUC0-t分別為（3.06±1.07）μg/ml·h、（13.16±0.53）μg/ml·h（P＜0.01）

2.5 血液中藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)(PK/PD)參數(shù)比較

結(jié)合相關(guān)報(bào)道的最低抑菌濃度(MIC)[7]及防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)[8]值，將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果Cmax和AUC0-∞與之相比，莫西沙星對(duì)肺炎鏈球菌的PK/PD 參數(shù)見(jiàn)表2[莫西沙星對(duì)肺炎鏈球菌的MIC90為0.125 mg/L；莫西沙星對(duì)肺炎鏈球菌的MPC90為2 mg/L]。

3 討論

我國(guó)的多中心研究結(jié)果顯示，莫西沙星對(duì)肺炎鏈球菌的敏感度達(dá)99%，MIC90為0.125 mg/L[7]。莫西沙星和青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物均無(wú)交叉耐藥性，口服生物利用度總計(jì)91%，可以被快速吸收并分布到血管外隙，穩(wěn)態(tài)時(shí)表觀分布容積可以達(dá)到21/kg。血漿蛋白結(jié)合率為45%，其在肺、竇及炎性損傷組織的藥物濃度超過(guò)血藥濃度。相關(guān)研究表明，口服莫西沙星400 mg 后，在人肺組織[8]、微支氣管鏡肺泡灌洗液[9]、痰液[10]中的藥時(shí)曲線(xiàn)與在血漿中的趨勢(shì)相似，藥物在以上樣本中的濃度高于血漿，顯示出良好組織穿透性，本研究的前期結(jié)果也得出相似的結(jié)論[11]。

表1 灌胃給予莫西沙星的正常大鼠與肺炎大鼠血漿和肺組織中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表2 正常大鼠和肺炎大鼠體內(nèi)莫西沙星的PK/PD 參數(shù)比較

莫西沙星為濃度依賴(lài)性抗菌藥，抗生素后效應(yīng)(PAE)較長(zhǎng)，喹諾酮類(lèi)治療革蘭陽(yáng)性菌所需的AUC0-24h/MIC 靶值為30～40。當(dāng)PK/PD 參數(shù)Cmax/MIC≥8～10 和AUC0～24h/MIC≥125 時(shí)可以明顯減少氟喹諾酮類(lèi)藥物治療革蘭陰性桿菌、包括銅綠假單胞菌耐藥菌出現(xiàn)的危險(xiǎn)性[12]。本研究結(jié)果表明，莫西沙星在正常及肺炎鏈球菌感染大鼠血漿和肺組織的Cmax/MIC 均遠(yuǎn)大于8～10，在肺炎大鼠的血漿及肺組織的AUC0-24h/MIC 為135.68 和167.44，正常大鼠血漿為188.08，遠(yuǎn)大于125。

耐藥突變選擇窗（MSW）是指防耐藥突變濃度（MPC）與最低抑菌濃度（MIC）之間的濃度范圍；當(dāng)治療藥物濃度高于MPC 時(shí)，在保證療效的同時(shí)也能防止耐藥突變；藥物濃度如果在突變選擇窗內(nèi)，即使抑制了敏感菌生長(zhǎng)，臨床治療可能成功，但還可能導(dǎo)致耐藥突變。近年來(lái)在優(yōu)化喹諾酮類(lèi)給藥方案的研究中，常需評(píng)價(jià)抗菌藥物在耐藥突變窗中的存在時(shí)間百分比和MPC 值。TMSW＜20%是預(yù)測(cè)防止出現(xiàn)耐藥的有效參數(shù)，本研究藥動(dòng)學(xué)參數(shù)顯示，莫西沙星在正常大鼠及肺炎大鼠的血漿和肺組織中的濃度基本保持在莫西沙星耐藥突變選擇窗之外。

藥物常規(guī)劑量是在群體藥動(dòng)學(xué)結(jié)果和有限臨床實(shí)踐上建立的，大多數(shù)患者按照常規(guī)劑量會(huì)獲得較好的臨床療效和安全性，但患者個(gè)體差異，生理病理狀態(tài)都會(huì)對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)產(chǎn)生一定影響。近年來(lái)，關(guān)于抗菌藥物PK/PD 的研究進(jìn)展迅速，研究發(fā)現(xiàn)重癥感染患者與健康人的PK/PD 數(shù)據(jù)明顯不同，例如萬(wàn)古霉素在重癥感染患者群體分布相較正常人群快，患者存在高代謝和高循環(huán)動(dòng)力狀態(tài)，因而需要對(duì)治療藥物監(jiān)測(cè)與給藥方案的調(diào)整[13]。一項(xiàng)大樣本臨床研究表明莫西沙星最常見(jiàn)的藥物不良反應(yīng)為胃腸道癥狀，口服劑量400 mg/d，發(fā)生惡心、腹瀉和頭暈不良反應(yīng)事件概率分別為7.1%、5.2%和2.6%[14]。國(guó)內(nèi)也有莫西沙星不良反應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，此外，莫西沙星的中樞神經(jīng)系統(tǒng)潛在危險(xiǎn)與其他喹諾酮類(lèi)藥物一致[17],因此老年人、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的老年患者（如癲癇、明顯動(dòng)脈硬化）應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用，必要時(shí)減量，但目前尚無(wú)莫西沙星劑量調(diào)整的相關(guān)依據(jù)。

機(jī)體發(fā)生感染后,病原菌釋放內(nèi)毒素和外毒素,誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng),大量的細(xì)胞因子炎性介質(zhì)釋放,引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡,血管內(nèi)皮破壞和毛細(xì)血管通透性增加,導(dǎo)致體液向第三間隙滲漏遷移[18]，這一過(guò)程會(huì)使組織間分布的親水性抗生素藥物稀釋?zhuān)獫{和組織藥物濃度下降，對(duì)親脂性藥物影響不大[19]。此外藥物在體內(nèi)以一定比例與血漿蛋白結(jié)合, 感染狀態(tài)下血管通透性增加，蛋白向血管外間隙滲漏增加，以及肝臟合成減少，血漿白蛋白減低引起藥物游離比例增多，這可能會(huì)增加組織內(nèi)抗生素分布而增加抗感染效果，但同時(shí)可能增加藥物的毒性作用[20]，莫西沙星是表觀分布容積較高的脂溶性藥物，在感染狀態(tài)肺組織濃度較健康狀態(tài)增高，可能與血管通透性增加，血漿蛋白結(jié)合率降低有關(guān)。

有研究表明喹諾酮類(lèi)抗菌藥物馬波沙星在感染小鼠肺組織的藥物濃度是血漿藥物濃度的2～3 倍[21]，多殺性巴氏桿菌感染顯著增加了馬波沙星的AUC、Cmax、MRT，這與本研究結(jié)論相似。肺炎模型大鼠與正常大鼠相比，莫西沙星在血漿中的濃度沒(méi)有顯著差異，而在肺炎大鼠肺組織中的濃度明顯高于正常大鼠，最高為正常大鼠肺組織的3.4 倍，這提示在肺炎鏈球菌感染的病理狀態(tài)下，莫西沙星的肺組織穿透率升高。

莫西沙星在正常小鼠和肺炎鏈球菌感染小鼠的血漿和肺組織濃度均能夠達(dá)到殺滅細(xì)菌并防止產(chǎn)生耐藥性的要求。在感染狀態(tài)下機(jī)體高敏、肝腎功能減退等病理因素可能增加莫西沙星不良反應(yīng)的發(fā)生概率，而在肺炎病理狀態(tài)下，莫西沙星肺組織AUC0-24h/MIC 達(dá)到167.44，目前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明小鼠肺炎鏈球菌感染時(shí)莫西沙星肺組織濃度遠(yuǎn)高于健康狀態(tài)，也遠(yuǎn)大于MIC 和MPC，理論上有一定劑量調(diào)整的空間，其機(jī)制和具體方案還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，為優(yōu)化特殊病人給藥方案，調(diào)整藥物劑量，減少藥物不良反應(yīng)提供可參考的數(shù)據(jù)。