董子奕，應(yīng) 銘，楊 希，馬 伊

0引言

2015年國(guó)際干眼病工作組[1]全面修訂了對(duì)干眼病(dry eye disease, DED)的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為DED是一種多因素導(dǎo)致的眼表疾病，特征是淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀，水液不足型是常見(jiàn)的干眼亞型之一。炎癥因子是常見(jiàn)的致病因素之一[2-3]。隨著發(fā)病率的升高，干眼癥越來(lái)越得到重視[4]，建立穩(wěn)定、高效的干眼癥動(dòng)物模型成為了深入探索干眼癥發(fā)病機(jī)制和觀察治療效果的有力工具。在正常飼育環(huán)境下，建立水液不足型干眼癥動(dòng)物模型主要有兩類手段：一類為手術(shù)干預(yù)，例如摘除淚腺、手術(shù)去勢(shì)等方法；另一類為藥物誘導(dǎo)，比如眼瞼涂抹阿托品眼膏、淚腺注射肉毒桿菌毒素等[5]。本實(shí)驗(yàn)分別采用了摘除淚腺以及淚腺注射肉毒桿菌毒素A(botulinum toxin A,BTX-A)誘導(dǎo)大鼠干眼癥模型，對(duì)比兩種水液缺乏型干眼癥模型的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)特點(diǎn)以及細(xì)胞因子變化，進(jìn)而分析兩種干眼癥動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本研究中涉及大鼠的所有程序均經(jīng)天津市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合《視覺(jué)與眼科研究協(xié)會(huì)(ARVO)關(guān)于動(dòng)物用于眼科和視力研究的聲明》的指導(dǎo)方針。選取健康8周齡雄性Brown Norway(BN)大鼠30只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，體質(zhì)量200～250g，清潔級(jí)飼養(yǎng)。隨機(jī)分為3組，每組各10只，均選取左眼為實(shí)驗(yàn)眼，第一組左眼不予任何處理作為空白組(A組)，第二組摘除左側(cè)主淚腺(B組)，第三組左側(cè)淚腺注射肉毒桿菌毒素A(C組)。A、B、C組各10眼。

1.1.2主要藥品和試劑注射用A型肉毒毒素：美國(guó)艾爾建制藥有限公司；淚液檢測(cè)酚紅棉線，熒光素鈉試紙：天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒：北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。引物設(shè)計(jì)：大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)并合成引物。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立A組大鼠左眼不做任何處理。制作摘除主淚腺干眼癥動(dòng)物模型：將B組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)，待動(dòng)物麻醉后，于左耳下約1cm處做縱行切口，左眼外側(cè)1cm處做橫行切口，暴露皮下見(jiàn)眶外淚腺，分離周圍組織，將其完整摘除，逐層縫合關(guān)閉傷口。制作淚腺注射肉毒桿菌毒素A干眼癥動(dòng)物模型：將C組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)，待動(dòng)物麻醉后在手術(shù)顯微鏡下暴露左側(cè)淚腺，淚腺注射肉毒桿菌毒素A 0.1mL(20mU)。將大鼠置于溫度為24℃±2℃，濕度為50%，早8∶00至晚8∶00照明，其余時(shí)間黑暗環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2.2干眼癥動(dòng)物模型檢查項(xiàng)目分別于實(shí)驗(yàn)前1d及實(shí)驗(yàn)后3、7、14、28、42d，將大鼠進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉后檢測(cè)淚液分泌試驗(yàn)(SⅠt)、淚膜破裂時(shí)間(BUT)以及角膜熒光染色評(píng)分并在照相裂隙顯微鏡下拍照記錄。淚液分泌試驗(yàn)：根據(jù)Fujihara等[6]的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將一張淚液分泌酚紅棉線放入大鼠下瞼外1/3處，1min后讀取條紋濕潤(rùn)長(zhǎng)度并精確到0.1mm。淚膜破裂時(shí)間：將10%熒光素鈉溶液滴于大鼠結(jié)膜囊內(nèi)，使熒光素均勻分布于大鼠眼表面，固定眼瞼，通過(guò)裂隙燈鈷藍(lán)光觀察，記錄從最后1次閉眼開(kāi)始至淚膜出現(xiàn)第1個(gè)破裂點(diǎn)時(shí)所需時(shí)間，取3次的觀察時(shí)間取平均值。熒光素鈉染色評(píng)分：將10%熒光素鈉溶液滴入大鼠結(jié)膜囊內(nèi)，裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察1min后角膜染色的情況并評(píng)分。參照Koh等[7]的方法，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：將角膜分為四個(gè)象限分別評(píng)分，分?jǐn)?shù)相加為最終得分。0分：無(wú)著染；1分：點(diǎn)狀著染≤30個(gè)；2分：點(diǎn)狀著染>30個(gè)，但不彌散；3分：嚴(yán)重的點(diǎn)狀著染但不融合成片；4分：著染成斑片狀。所有檢查均由同一名檢查者在同一時(shí)間(AM9∶00～12∶00)，同一地點(diǎn)、溫度、濕度及照明情況下完成。

1.2.3病理學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)后第42d，隨機(jī)從每組中各取出2只大鼠過(guò)量麻醉處死，立即摘除左側(cè)眼球，A,C組摘除左側(cè)淚腺組織，4%多聚甲醛固定標(biāo)本24h，然后用流水沖洗2h，蒸餾水沖洗30min，浸泡于100%、95%、80%、70%乙醇中各5min脫水，二甲苯溶液中透明，60℃石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為7μm，45℃攤片，60℃烤片，常規(guī)脫蠟入水，蘇木精染色試劑盒染色5min，然后用溫水沖洗3min，取出蘇木精。然后將其浸泡在含0.01% HCl的伊紅中1min，最后用自來(lái)水沖洗10min。同樣進(jìn)行PAS染色，最后觀察角膜、結(jié)膜、淚腺的病理變化。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)測(cè)定上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)后第42d，處死余下大鼠，分別取左眼結(jié)膜及角膜組織，使用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參對(duì)照的校準(zhǔn)基因(PCR擴(kuò)增細(xì)胞的標(biāo)志性基因)。引物序列：EGF上游引物為5’-TCGGTGCTGTGCGATTTA-3’,下游引物為 5’-TTTCTGGCAGTTCTCCTC-3’;IL-6上游引物為5’-CAGTTGCCTTCTTGGGACT-3’，下游引物為3’-GCTCTGAATGACTCTGGCTT-5’；TNF-α上游引物為5’-CACGTCGTAGCAAACCACCAA-3’，下游引物為3’-GTTGGTTGTCTTTGAGATCCAT-5’。采用SYBR green I作為熒光信號(hào)對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，通過(guò)計(jì)算2-△△ct值取平均值繪制各指標(biāo)表達(dá)量對(duì)比圖。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；94℃ 15s、60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s至反應(yīng)結(jié)束。

2結(jié)果

2.1淚液分泌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)后第3d，B組與C組均出現(xiàn)淚液分泌量持續(xù)性減少，B、C組在第14d分別減少至3.83±0.41mm以及3.61±0.71mm，A組為7.34±0.31mm，與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其后B、C組淚液分泌量維持穩(wěn)定。B、C組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 A、B、C組淚液分泌試驗(yàn)酚紅棉線長(zhǎng)度測(cè)量比較

2.2淚膜破裂時(shí)間測(cè)定實(shí)驗(yàn)后第3d，各組淚膜破裂時(shí)間未見(jiàn)差異改變(P>0.05)。第7d，B組與C組開(kāi)始出現(xiàn)淚膜破裂時(shí)間縮短，B、C組淚膜破裂時(shí)間在第28d分別縮短為6.03±0.43、6.20±0.40s，A組為10.87±0.59s，與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其后B、C組淚膜破裂時(shí)間維持穩(wěn)定。B、C組間比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 A、B、C組淚膜破裂時(shí)間檢測(cè)比較

2.3角膜染色評(píng)分A組角膜上皮光滑，經(jīng)熒光素鈉染色后角膜上皮偶見(jiàn)獨(dú)立點(diǎn)狀著染，未見(jiàn)彌散的點(diǎn)狀著染(圖1A)。實(shí)驗(yàn)后第7d，B、C組角膜上皮點(diǎn)染數(shù)量逐漸增多，提示角膜上皮粗糙，但未見(jiàn)明顯片狀融合，隨后B、C組角膜點(diǎn)染明顯增多，逐漸出現(xiàn)片狀染色(圖1B、C)。B、C組角膜評(píng)分在實(shí)驗(yàn)后第28d分別為5.8±1.5、5.5±1.4分，A組為0.8±0.6分，與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其后B、C組角膜評(píng)分維持穩(wěn)定。B、C組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

圖1 第42d角膜上皮熒光素鈉染色

表3 A、B、C組角膜熒光素鈉染色評(píng)分結(jié)果 分)

2.4病理學(xué)檢查結(jié)果HE染色：A組角膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，上皮完整連續(xù)?；讓蛹?xì)胞排列緊密，分布整齊(圖2A)。B、C組角膜上皮均存在不同程度表層細(xì)胞絲狀分離，角膜上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，上皮點(diǎn)狀脫落，角膜基質(zhì)細(xì)胞體積明顯增大，排列無(wú)序，胞核固縮，呈多角狀增生(圖2B、C)。A組正常淚腺可見(jiàn)腺泡規(guī)則，排列緊密，腺上皮細(xì)胞核正常、深染，胞漿淡染(圖3A)；C組萎縮淚腺可見(jiàn)腺泡不清晰，排列疏松，腺上皮細(xì)胞變性，細(xì)胞核消失，胞漿紅染(圖3B)。PAS染色：B、C組結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目較A組明顯減少，胞體萎縮，體積減少，結(jié)膜上皮呈鱗狀化生(圖2D～F)。

圖2 HE和PAS染色

圖3 淚腺病理改變(×200)

2.5 RT-PCR結(jié)果先觀察熔解曲線，所有引物的熔解曲線均只出現(xiàn)單峰，說(shuō)明反應(yīng)具有特異性。結(jié)膜組織：細(xì)胞因子EGF、TNF-α和IL-6在B組及C組中表達(dá)量均顯著增高(F=10.78，P=0.001；F=32.48，P<0.001；F=30.80，P<0.001)，B、C組EGF表達(dá)量分別為A組的2.73±1.38倍和3.19±1.04倍；B、C組IL-6表達(dá)量分別為A組的4.96±1.63倍和2.17±0.75倍；B、C組TNF-α表達(dá)量分別為A組的3.96±1.34倍和3.74±0.70倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B、C組間比較，EGF及TNF-α的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.826、0.967)，IL-6表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，見(jiàn)圖4A。角膜組織：細(xì)胞因子EGF、TNF-α和IL-6在B組及C組中表達(dá)量均顯著增高(F=12.86，P<0.001；F=17.39，P<0.001；F=60.15，P<0.001)，B、C組EGF表達(dá)量分別為A組的2.46±1.03倍和3.78±1.60倍；B、C組IL-6表達(dá)量分別為A組的6.95±1.35倍和4.25±1.31倍；B、C組TNF-α表達(dá)量分別為A組的4.35±1.90倍和4.16±1.13倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B、C組間比較，EGF及TNF-α的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.196、0.993)，IL-6表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，見(jiàn)圖4B。

圖4 RT-PCR結(jié)果

3討論

干眼癥的發(fā)生與淚液的分泌或蒸發(fā)異常密切相關(guān)[8]，而淚液通過(guò)瞬目運(yùn)動(dòng)涂抹在眼表形成一層超薄的淚膜，自外至內(nèi)分成脂質(zhì)層、水樣層和粘蛋白層，任何一層結(jié)構(gòu)異常均可導(dǎo)致干眼癥的發(fā)生。大鼠的淚器包括淚腺、淚腺排出管及鼻淚管。主淚腺在激素和神經(jīng)的調(diào)控下分泌出淚液，構(gòu)成了淚膜水樣層的主要成分，因此摘除大鼠主淚腺可以制作干眼癥動(dòng)物模型[9]。淚腺的神經(jīng)支配非常豐富，通過(guò)來(lái)自于面神經(jīng)的副交感神經(jīng)和來(lái)自頸上神經(jīng)節(jié)的細(xì)小交感神經(jīng)纖維共同支配調(diào)節(jié)。肉毒桿菌毒素是一種嗜神經(jīng)毒素，能夠抑制副交感神經(jīng)末梢鈣離子介導(dǎo)的乙酰膽堿的釋放，有A～G7亞型，其中A型和B型最為常見(jiàn)。有報(bào)道證實(shí)淚腺注射BTX-B后淚腺腺泡發(fā)生去神經(jīng)性萎縮，最終導(dǎo)致淚液分泌減少[10]，但此種方式構(gòu)建的干眼模型存在穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。BTX-A型最早使用于臨床，其藥物毒性比B型低，藥效持續(xù)時(shí)間比B型久，因此我們推測(cè)BTX-A注射淚腺后可以構(gòu)建穩(wěn)定的干眼模型。

淚腺摘除組和淚腺注射BTX-A組從實(shí)驗(yàn)后第3d開(kāi)始均出現(xiàn)了淚液分泌量持續(xù)性減少，第7d淚膜破裂時(shí)間開(kāi)始持續(xù)性縮短，第28d達(dá)到最低點(diǎn)并維持穩(wěn)定，角膜上皮變得粗糙糜爛，有熒光著染甚至潰瘍斑片出現(xiàn)，角膜上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，上皮點(diǎn)狀脫落，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，BTX-A組的淚腺腺體嚴(yán)重萎縮，以上結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)得到的模型均符合水液缺乏型干眼的臨床特點(diǎn)和病理學(xué)特征。淚腺摘除組和淚腺注射BTX-A組在第3d同時(shí)出現(xiàn)了淚液分泌量的減少，和既往研究中BTX-B造模后3d出現(xiàn)淚液分泌減少的結(jié)果相一致[5,10]，說(shuō)明了BTX-A起效迅速，可以快速地引起淚腺的萎縮。Lin等[11]研究發(fā)現(xiàn)BTX-B干眼模型在造模28d后會(huì)出現(xiàn)淚液分泌量升高，模型存在欠穩(wěn)定等缺點(diǎn)，可能和BTX-B藥物有效時(shí)間短，淚腺暫時(shí)性萎縮有關(guān)[5]，但本實(shí)驗(yàn)的BTX-A組沒(méi)有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，提示了BTX-A構(gòu)建的干眼模型更加穩(wěn)定。淚腺摘除組和淚腺注射BTX-A組組間比較沒(méi)有差異，說(shuō)明這兩種造模方式構(gòu)建的干眼模型在臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度方面是沒(méi)有差別的。由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)中兩種方法構(gòu)建的干眼癥模型是成功的。

越來(lái)越多的研究表明，炎癥在干眼的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵的作用[12]，多種炎癥因子[13]已被證實(shí)參與了干眼的病變過(guò)程，在損傷角膜上皮結(jié)構(gòu)，破壞淚膜穩(wěn)定性等方面扮演了重要角色，其中IL- 6和TNF-α尤為重要，它們同屬細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的核心成員。IL-6是一種調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，是B細(xì)胞和T細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子，干眼患者結(jié)膜上皮多種炎性因子增高，而IL-6是最有價(jià)值的[14]。RT-PCR結(jié)果顯示摘除淚腺組和注射BTX-A組IL-6因子表達(dá)量均明顯的提升，摘除淚腺組高于注射BTX-A組，此結(jié)果證實(shí)了淚腺缺如或淚腺萎縮可以引起IL-6的升高，并且猜測(cè)升高的程度可能和淚腺缺損程度呈正相關(guān)。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物活性，可以改變多重靶細(xì)胞的功能，TNF-α是細(xì)胞黏附和趨化的主要介質(zhì)，主要負(fù)責(zé)炎癥期間細(xì)胞遷移的調(diào)控。Oshida等[15]指出干眼患者淚液中TNF-α的濃度增高，且濃度高的患者熒光素染色評(píng)分高，這表明淚液中TNF-α含量與角膜上皮受損情況呈正相關(guān)，暗示TNF-α也是干眼癥發(fā)生的炎性介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)顯示兩個(gè)模型組的TNF-α因子表達(dá)量升高，且兩組間比較沒(méi)有差異，與熒光素鈉染色及病理學(xué)檢查結(jié)果相一致。由此證實(shí)，淚腺萎縮或缺如導(dǎo)致淚液分泌量減少，淚液滲透壓升高，進(jìn)而激活I(lǐng)L-6和TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

EGF是一種可以修復(fù)上皮組織，對(duì)抗損傷的因子。先前研究中發(fā)現(xiàn)EGF在干燥綜合征患者的淚液，淚腺或唾液腺中的表達(dá)明顯降低[16]，但也有證據(jù)[17-18]表明干眼導(dǎo)致的角膜損傷可以引起EGF的升高。本實(shí)驗(yàn)兩種造模方式均可以引起EGF的升高，推測(cè)是否和主淚腺受損及角膜上皮損傷后的代償性反應(yīng)相關(guān)，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。目前對(duì)于EGF的評(píng)價(jià)呈兩極分化，一方面EGF可以促進(jìn)角膜上皮傷口的愈合，另一方面EGF的升高可能與腫瘤相關(guān)。因此干眼癥中EGF的表達(dá)變化，是否采用EGF治療，如何使用EGF是安全有效的，這些問(wèn)題值得進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了兩種誘導(dǎo)水液缺乏型干眼癥動(dòng)物模型的方法：摘除淚腺法模型表現(xiàn)穩(wěn)定，缺點(diǎn)是手術(shù)會(huì)造成不可逆的淚腺缺如，并且手術(shù)創(chuàng)傷大，要求一定的手術(shù)技巧，此種模型適合于觀察人工淚液等代替治療的療效，但不適用于觀察針對(duì)于淚腺治療的效果；淚腺注射BTX-A制備的模型穩(wěn)定性與淚腺摘除法相近，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，其導(dǎo)致的淚腺萎縮更貼合于人類疾病的特點(diǎn)，適合于藥物或干細(xì)胞修復(fù)淚腺功能以及治療角膜損傷等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。但BTX-A有一定的藥物毒性，是否對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成其他不良影響有待于進(jìn)一步觀察。每一種動(dòng)物模型均有其優(yōu)點(diǎn)，也有其弊端，因此在進(jìn)行干眼病理及藥理研究的過(guò)程中，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇合適的動(dòng)物模型。