肖維瑋，盧一辰，熊曉輝

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

敵草隆(diuron，DU)是一種苯基脲類除草劑，其化學(xué)名稱為N-(3，4-二氯苯基)-N，N-二甲基脲，被廣泛應(yīng)用于小麥和水稻田中去除一年生和多年生闊葉、雜草[1]。大量研究表明，敵草隆及其代謝產(chǎn)物的環(huán)境持久性致使其環(huán)境殘留物過量積累，對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)植物產(chǎn)生毒性作用，甚至有研究發(fā)現(xiàn)敵草隆代謝產(chǎn)物可能對(duì)人類健康和生殖產(chǎn)生嚴(yán)重影響，濃度為5 mmol/L的敵草隆主要代謝產(chǎn)物3，4-DCA能夠在半小時(shí)內(nèi)對(duì)人類精子產(chǎn)生損傷[2-3]，可見對(duì)環(huán)境和食品全鏈條的敵草隆殘留物進(jìn)行檢測和監(jiān)控勢在必行。近年來，已陸續(xù)建立了高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜法(GC)等測定環(huán)境樣品中敵草隆的分析方法。然而，這些方法受儀器、高檢測成本以及前處理步驟繁瑣的限制，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)階段大量樣品的快速檢測篩查需求[4]。因而，開發(fā)一種簡單、靈敏、廉價(jià)、快速的分離檢測環(huán)境或食品介質(zhì)中的敵草隆分析方法具有重要意義。

1972年，Wulff等[5]首次報(bào)道通過共價(jià)法合成了分子印跡聚合物(MIPs)，因其具有靶標(biāo)化合物契合的空穴結(jié)構(gòu)，對(duì)目標(biāo)物具有類似于“抗體-抗原”的特異結(jié)合能力，開始引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注。以茶堿為模板，采用非共價(jià)法合成的印跡材料在《Nature》上發(fā)表后，在學(xué)術(shù)圈引起了巨大反響[6]，其解決了共價(jià)法引起的模板不易洗脫的難題，使得分子印跡材料成為研究熱門。劉嬌等[7]使用本體聚合方法制備了能夠?qū)谆鶎?duì)硫磷進(jìn)行特異性吸附的分子印跡材料，其飽和吸附量可達(dá)625.5 μmol/g，可用于水樣中甲基對(duì)硫磷的富集與分析。田景升等[8]使用表面分子印跡技術(shù)，以Fe3O4@SiO2為載體、甲基丙烯酸酯為功能單體、聯(lián)苯三唑醇為模板分子，制備了聯(lián)苯三唑醇分子印跡聚合物。Uygun等[9]在石墨電極上電聚合吡咯，制備了能夠?qū)Χ舅莉缣禺愋晕降姆肿佑≯E膜，其制備的傳感器具有成本低、選擇性優(yōu)良、靈敏度高等特點(diǎn)。分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)物具有較高的選擇性，且物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，制備過程簡單，易保存。基于上述特性，分子印跡材料作為優(yōu)良的前處理材料大量應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品之中，例如：固相萃取和固相微萃取材料[10-11]、色譜固定相材料[12]以及分子印跡傳感器[13]等。

近年來，以分子印跡聚合物為識(shí)別元件，結(jié)合不同類型的轉(zhuǎn)換器而制得的分子印跡傳感器，其兼具生物傳感器的專一識(shí)別性和化學(xué)傳感器的力學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，成為傳感器研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。電化學(xué)傳感器的高超靈敏性易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性較差。為了改善這一問題，許多研究者將具有選擇性識(shí)別位點(diǎn)的分子印跡材料與電化學(xué)傳感器相結(jié)合[14]，來達(dá)到同步專一性識(shí)別和檢測目標(biāo)物的目的。傳統(tǒng)的電化學(xué)MIPs傳感器采用電聚合修飾的分子印跡膜，面臨著電極修飾步驟繁瑣、刷新電極表面耗時(shí)長等問題，限制了分子印跡電化學(xué)傳感器的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展[15-16]。因此，開發(fā)更為便捷的整合方式尤為重要。

磁性分子印跡材料的開發(fā)給打破繁瑣電極修飾帶來了靈感。磁性分子印跡是以順磁性材料為核，在其表面聚合分子印跡層，在不影響其磁性的情況下通過添加一個(gè)外部磁場，使磁性分子印跡特異性結(jié)合目標(biāo)物后可以很容易地從樣品中分離出來，避免了耗時(shí)的離心步驟。這樣一個(gè)可控的重新綁定過程能夠簡單、快速地進(jìn)行磁分離操作。因此，若利用此類分子印跡材料的磁吸附性能和特異性吸附作用，有望簡化電極表面修飾過程和提高電化學(xué)傳感器的專一性，同時(shí)可消除傳統(tǒng)電極系統(tǒng)中再生困難等問題。

因此，本文中，筆者以敵草隆為模板分子，采用表面聚合方式在磁性Fe3O4納米粒子表面合成印跡材料，并通過磁吸附作用構(gòu)建一種新型的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器用于測定食品介質(zhì)中敵草隆的含量。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

敵草隆，遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；甲醇、乙腈、無水MgSO4、亞鐵氰化鉀、鐵氰化鉀、KCl(分析純)，廣東光華科技有限股份公司；甲基丙烯酸(MAA)、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水、異丙醇、甲基丙烯酸、偶氮二異丁氰(AIBN)、檸檬酸三鈉、Fe3O4(分析純)，阿拉丁有限公司；磁性玻碳電極(Φ=5 mm)、AgCl電極、鉑絲電極，天津英科聯(lián)合有限公司。

電子分析天平，上海天平儀器廠；組合式搖床，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；超純水器，北京普析通用儀器有限公司；真空干燥箱，上海精宏設(shè)備有限公司；CHI750E型電化學(xué)工作站，上海辰華科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性分子印跡材料合成

敵草隆磁性分子印跡材料參照文獻(xiàn)[17]方法。

首先，使用檸檬酸三鈉改性Fe3O4，稱取2.0 g Fe3O4納米粒子與0.1 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液混合超聲30 min，40 ℃ 條件下機(jī)械攪拌24 h(通氮?dú)?。待反應(yīng)結(jié)束后，離心收集產(chǎn)物，用超純水、丙酮清洗若干次，真空干燥保存?zhèn)溆?。接著用TEOS對(duì)改性Fe3O4進(jìn)行修飾，稱取1.0 g改性Fe3O4納米粒子分散在混有20 mL超純水、4 mL氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)32%)和120 mL 2-丙醇的溶液中。超聲處理30 min后，緩慢滴入含有20 mL的2-丙醇和6 mL的TEOS混合溶液中，機(jī)械攪拌20 h(通氮?dú)?，用磁鐵收集Fe3O4@SiO2產(chǎn)物，并用超純水和乙醇清洗若干次，真空干燥保存。

然后，用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)對(duì)制備的Fe3O4@SiO2進(jìn)行修飾，稱取300 mg Fe3O4@SiO2分散在90 mL甲醇溶液中，通N2機(jī)械攪拌5 min后緩慢滴入5 mL MPS-甲醇溶液(體積比為1∶ 4)，接著在30 ℃條件下繼續(xù)攪拌24 h。使用磁鐵收集產(chǎn)物，并用甲醇清洗若干次，真空干燥保存。

最后，取0.625 mmol/L敵草隆和2.5 mmol/L甲基丙烯酸(MAA)溶解在乙腈溶液中，冰浴條件下攪拌12 h進(jìn)行預(yù)聚合反應(yīng)。在上述溶液中添加300 mg的Fe3O4@SiO2@MPS，N2保護(hù)下攪拌3 h后，將9 mmol/L 三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、50 mg偶氮二異丁腈溶于乙腈后加入上述反應(yīng)物中引發(fā)聚合。首先在50 ℃下攪拌反應(yīng)6 h，接著在60 ℃下攪拌反應(yīng)24 h(全程N(yùn)2保護(hù))。在不存在模板分子敵草隆的條件下，其他相關(guān)的合成條件與敵草隆印跡聚合物(DUMIPs)相同，制備敵草隆非印跡聚合物(DUNIPs)。合成反應(yīng)結(jié)束后，以甲醇-醋酸溶液(體積比9∶ 1)為洗脫液，使用索氏提取法在110 ℃條件下對(duì)聚合物進(jìn)行洗脫，在250 nm處檢測洗脫液的濃度，直至洗脫液中無法檢測出敵草隆，真空干燥保存。

此外，隨著全球氣候變化，極端干旱、洪澇災(zāi)害事件在增加。應(yīng)對(duì)氣候變化對(duì)灌排工程的改造和發(fā)展也提出了更高的要求。水利設(shè)施是提高農(nóng)田生產(chǎn)效率的重要基礎(chǔ)設(shè)施。今后糧食的增長和解決灌溉水資源短缺的問題必須依靠提高灌溉用水效率和效益。但從現(xiàn)實(shí)來看，缺乏灌排設(shè)施，以及已有灌排設(shè)施的老化是發(fā)展中國家和最不發(fā)達(dá)國家面臨的一個(gè)較為普遍的問題。面對(duì)這些問題，一些國家缺乏在國家層面上的政策支持，缺乏資金和技術(shù)，無力開展灌排工程設(shè)施的改造和升級(jí)。

1.2.2 電化學(xué)傳感器的制備

將磁性玻碳電極放在加有泥狀A(yù)l2O3(0.05 μm)的麂皮上進(jìn)行拋光打磨，依次放入無水乙醇和超純水中超聲清洗以除去電極表面的Al2O3粉末及其他雜質(zhì)；在-0.2～1.2 V的電位下，將磁性玻碳電極放置在0.5 mol/L的H2SO4溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法的掃描，直至得到較為穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。將3 mg的磁性分子印跡聚合物放入10 mL不同濃度的敵草隆溶液中，搖床吸附30 min，使磁性MIPs與敵草隆充分結(jié)合。5 min內(nèi)將磁性玻碳電極插入敵草隆溶液中，通過磁力作用將溶液中已吸附完全的印跡材料固定到電極表面。

1.2.3 電化學(xué)傳感器的測定

以50 mL含有0.1 mol/L KCl的2.5 mmol/L的Fe(CN)63-/4-作為電解液，磁性玻碳電極作為工作電極，AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，用循環(huán)伏安法(CV)和示差脈沖伏安法(DPV)對(duì)修飾電極和裸電極進(jìn)行了表征。循環(huán)伏安(CV)模式下掃描范圍為0～0.55 V，掃描速率為100 mV/s。示差脈沖測量(DPV)模式下，脈沖寬度為50 ms，脈沖振幅為25 mV，脈沖周期為50 ms，電位增量為5 mV。所有測量均在室溫條件下進(jìn)行，且最終靶標(biāo)檢測的電化學(xué)方法與上述相同。

1.2.4 實(shí)際樣品制備

取2 mg MIP加入到5 mL含不同濃度(0.2、1、4 mg/L)的敵草隆自來水樣品中，25 ℃下振蕩吸附30 min。接著將磁性玻碳電極插入到電解液中2 min，通過磁吸附作用，使得溶液中的MIP固定到玻碳電極表面。茶飲料樣品的制備過程與此相同。

取5 g大白菜切片(約1 cm×1 cm)，加入5 mL不同濃度的敵草隆，靜置30 min后加入10 mL甲醇到樣品中，超聲20 min。然后將混合物8 000 r/min離心10 min。接著在50 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中使上清液揮發(fā)干燥，用200 μL甲醇溶解殘余敵草隆，并用5 mL超純水稀釋。吸附過程與水樣相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡的合成與電化學(xué)的檢測原理

圖1展示了磁性分子印跡的合成和電化學(xué)的檢測過程。

圖1 磁性分子印跡的合成和電化學(xué)的檢測

如圖1所示，所合成的磁性分子印跡材料以Fe3O4為內(nèi)核，使用檸檬酸三納對(duì)其改性，增加其分散性，接著使用TEOS對(duì)檸檬酸鹽改性的Fe3O4進(jìn)行修飾，在其表面包裹了一層SiO2阻礙磁珠的團(tuán)聚和氧化。接著使用MPS對(duì)Fe3O4@SiO2進(jìn)行修飾，雙鍵的接枝便于后續(xù)聚合反應(yīng)的進(jìn)行。然后，以DU為模板分子、MAA為功能單體，TRIM為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，通過自由基引發(fā)聚合，在MPS-Fe3O4@SiO2表面合成敵草隆印跡聚合物。使用磁性玻碳電極，通過磁力作用，將吸附了敵草隆的磁性分子印跡材料固定到玻碳電極表面，在含有0.1 mol/L KCl的2.5 mmol/L的Fe(CN)63-/4-溶液中進(jìn)行脈沖伏安法的檢測，導(dǎo)電的敵草隆分子增強(qiáng)了電解液中電子的傳遞，因此，隨著敵草隆濃度的增高，所檢測循環(huán)伏安法的電流值越大。

2.2 敵草隆導(dǎo)電性的驗(yàn)證

為了考察敵草隆的導(dǎo)電性，將裸電極分別放入空白溶液和敵草隆溶液中，通過CV法觀察其信號(hào)的變化。圖2為玻碳電極檢測空白和不同濃度敵草隆溶液的CV圖譜。

由圖2可知，玻碳電極在敵草隆溶液中的氧化還原信號(hào)高于空白溶液。同時(shí)，隨著敵草隆的濃度從0.000 1增大到0.001 mmol/L，氧化峰電流和還原峰電流逐漸增大。因此，說明敵草隆是導(dǎo)電物質(zhì)。導(dǎo)電的敵草隆分子可以促進(jìn)Fe(CN)63-/4-發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使得溶液中的電子通過印跡空穴轉(zhuǎn)移到磁性玻碳電極表面，因此，隨著敵草隆濃度的增加，靶標(biāo)電信號(hào)也隨之提升。

圖2 空白和0.000 1 mmol/L DU、0.001 mmol/L DU溶液在MGCE上的CV信號(hào)

2.3 磁性分子印跡材料添加量的優(yōu)化

電極表面的MIPs量是影響電信號(hào)傳導(dǎo)的重要因素。因此，為了優(yōu)化MIPs的添加量，將吸附不同量敵草隆的印跡材料(DUMIPs)與未吸附不同量敵草隆的印跡材料(CKMIPs)負(fù)載到玻碳電極表面，測量其電信號(hào)的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 敵草隆印跡材料在磁性玻碳電極(MGCE)上添加量的影響

由圖3可知，負(fù)載在玻碳電極表面MIPs的量對(duì)峰電流影響較大。隨著DUMIPs與CKMIPs的量從0.5 mg增加到2 mg，峰值電流逐漸降低，電流下降的原因可能是由于不導(dǎo)電的MIPs層阻礙了電子傳遞[17]。接著增加DUMIPs與CKMIPs的量，DUMIPs的電流繼續(xù)下降；然而，當(dāng)CKMIPs的量達(dá)到2 mg時(shí)，峰值電流急劇增加，其增加的原因是CKMIPs的量太多，導(dǎo)致非導(dǎo)電的MIPs層在電解質(zhì)溶液中脫落，因此，CKMIPs的峰值電流出現(xiàn)了先下降后上升的波動(dòng)。當(dāng)MIPs的量為2 mg時(shí)，DUMIPs和CKMIPs之間的峰值電流差異最明顯。同時(shí)，2 mg的MIPs足以完全覆蓋MGCE表面，不會(huì)在電解質(zhì)溶液中脫落。因此，使用2 mg MIPs修飾MGCE表面最佳。

2.4 MIP在MGCE表面負(fù)載時(shí)間的優(yōu)化

圖4顯示了負(fù)載時(shí)間對(duì)MIPs在MGCE上累積后產(chǎn)生的DPV電流響應(yīng)的影響。由圖4可知，在5～30 min時(shí)，峰值電流隨MIPs負(fù)載時(shí)間的變化不明顯，說明短時(shí)間內(nèi)DUMIPs通過磁性作用能很快與MGCE結(jié)合。因此，選擇5 min進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，可大大節(jié)省負(fù)載時(shí)間。

圖4 DUMIPs在玻碳電極表面負(fù)載時(shí)間的影響

2.5 MIPs、NIPs、Fe3O4@SiO2結(jié)合敵草隆效果的驗(yàn)證

為了考察分子印跡技術(shù)和磁性富集技術(shù)對(duì)敵草隆的吸附效果，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

a、b表明MIPs分別與NIP、Fe3O4@SiO2具有顯著性差異和非顯著性差異

由圖5可知，NIPs傳感器與Fe3O4@SiO2傳感器在吸附敵草隆模板前后，電流值并沒有明顯的改變。這是因?yàn)镹IPs傳感器和Fe3O4@SiO2傳感器沒有與敵草隆相匹配的空腔。而MIPs在吸附前后，其電流值呈現(xiàn)出一個(gè)較為明顯的改變，ΔIp=26.13 μA。這種顯著性差異表明MIPs選擇性位點(diǎn)的高效性。敵草隆位點(diǎn)位于印跡材料表面，方便吸附溶液中的敵草隆模板分子。由此表明分子印跡技術(shù)和磁性富集技術(shù)可大大提高該電化學(xué)傳感器的特異性。

2.6 電化學(xué)行為表征

圖6為Fe(CN)63-/4-溶液中裸電極和修飾電極的循環(huán)伏安圖。掃描速率為100 mV/s，掃描范圍為0～0.55 V。

圖6 裸MGCE(a)、模板去除前的MIPs(b)和模板去除后的MIPs(c)、非印跡材料(NIPs)(d)的循環(huán)伏安曲線(CV)

由圖6可知，曲線a顯示出一對(duì)明顯的裸電極的氧化還原峰，峰值電流為161.34 μA，峰值電位(△Ep)為101.12 mV。電極在被NIPs覆蓋后，未出現(xiàn)明顯的氧化還原峰(曲線d)，這是由于NIPs在聚合反應(yīng)時(shí)沒有敵草隆模板，印跡材料并沒有形成能夠?qū)巢萋∵M(jìn)行特異性吸附的空穴，從而阻止了電解液從溶液中轉(zhuǎn)移到電極表面[18]。曲線c為敵草隆模板分子去除后的曲線，與NIPs/MGCE相比，氧化還原峰值電流增加，由于NIPs的合成并沒有導(dǎo)電敵草隆分子的參與，因此NIPs也不存在能夠?qū)巢萋∵M(jìn)行特異性吸附的空穴，而MIPs在洗脫敵草隆分子之后，會(huì)留下特異性空腔，洗脫之后的空腔增強(qiáng)了Fe(CN)63-/4-通過MIPs層的擴(kuò)散，促進(jìn)了Fe(CN)63-/4-在傳感器上的氧化還原反應(yīng)[19]，但是，它的增強(qiáng)效率遠(yuǎn)低于結(jié)合敵草隆分子的MIPs。曲線b為敵草隆模板分子去除前的曲線，與去除敵草隆模板后的MIPs電流相比，電流明顯增大，可能是殘留在空腔中的敵草隆促進(jìn)了Fe(CN)63-/4-通過MIPs層的擴(kuò)散。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將制備好的MIPs分散在不同濃度的敵草隆溶液中，吸附5 min，結(jié)果如圖7所示。

圖7 DU的差分脈沖伏安法(DPV)信號(hào)

由圖7可知，檢測到的DPV信號(hào)隨著敵草隆濃度的增加而增加，這是因?yàn)楫?dāng)敵草隆分子進(jìn)入分子印跡層的空穴時(shí)，促進(jìn)了Fe(CN)63-/4-溶液中的電子轉(zhuǎn)移到磁性玻碳電極表面，改善了電化學(xué)響應(yīng)。敵草隆濃度在0.000 4～0.03 mmol/L范圍內(nèi)有著較好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.724 9x+0.024 7(R2=0.992 9)，且最低檢測限(LOD)為1.3×10-5mmol/L(S/N=3)。

2.8 實(shí)際樣品檢測

為了評(píng)價(jià)印跡傳感器的實(shí)際應(yīng)用性，在自來水、茶飲料和大白菜樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。向上述實(shí)際樣品分別直接添加質(zhì)量濃度為0.2、1、4 mg/L的敵草隆，采用優(yōu)化后的前處理和檢測方法測定實(shí)際樣品中的敵草隆含量。檢測的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表1所示。

由表1可知：敵草隆在3種實(shí)際樣品中的回收率分別為95.0%～101.5%、101.6%～110.0% 和100.5%～105.5%，且RSD值均小于9.6%。樣品的良好回收率和較低的RSD值表明該傳感器對(duì)快速測定敵草隆有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表1 實(shí)際樣品加標(biāo)回收率(n=3)

3 結(jié)論

以Fe3O4為內(nèi)核、SiO2為外殼所制備的磁性分子印跡聚合物，通過磁吸附作用使其固定到磁性玻碳電極表面，成功構(gòu)建了能夠定量檢測敵草隆的分子印跡電化學(xué)傳感器。敵草隆濃度在0.000 4～0.03 mmol/L內(nèi)可被定量檢測，檢測限(LOD)為1.3×10-5mmol/L。該方法成功用于不同實(shí)際樣品的敵草隆測定，驗(yàn)證了此傳感器用于真實(shí)樣品分析的能力。

所構(gòu)建的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器有如下優(yōu)點(diǎn)：①將分子印跡技術(shù)與磁性納米粒子相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)可控的重結(jié)合過程和簡單快速的磁分離；②磁性玻碳電極能夠?qū)崿F(xiàn)多樣品檢測，電極再生簡單；③成本低、響應(yīng)快、操作簡單，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測。因此，本文中筆者所構(gòu)建的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器為敵草隆的檢測創(chuàng)造了一個(gè)良好的平臺(tái)，同時(shí)在食品分析與環(huán)境監(jiān)測中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。