張 倩，馮晴霞，周正乙，李睿祺，方 雷，楊秋楠，盛 瑜，盧學春，杜培革，安麗萍

(1. 北華大學藥學院微生物與生化藥學教研室，吉林 吉林 132013；2. 解放軍總醫(yī)院血液科，北京 100853)

疲勞是由于長時間運動后造成體力和腦力損耗，從而對人們身體和心理產(chǎn)生影響的一種生理現(xiàn)象[1]。機體的能源物質(zhì)耗竭且供應不足、自由基積累脂質(zhì)過氧化反應增強和代謝產(chǎn)物堆積不能及時分解均為產(chǎn)生疲勞的主要原因[2]。長時間運動可導致腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生變化，引起神經(jīng)系統(tǒng)的機能改變，也會導致機體抗氧化功能減弱，從而影響學習記憶能力[3-4]。

刺五加(Acanthopanaxsenticosus)系五加科植物的干燥根和根莖，具有抗癌、抗輻射、抗衰老和抗疲勞等功能，其主要的活性單體成分為刺五加苷B(eleutheroside B，ELB)和刺五加苷E(eleutheroside E，ELE)，ELB占刺五加總苷的45%[5-8]。ELB是刺五加抗疲勞的主要活性成分，但其抗疲勞的機制尚不明確。研究[9]顯示：ELB對PC12細胞具有神經(jīng)保護作用，可增強其抗氧化能力。有關(guān)ELB對疲勞小鼠學習記憶功能影響的研究國內(nèi)外尚未見報道。本文作者以游泳訓練致疲勞的小鼠為模型，通過行為學實驗、生化指標檢測、HE染色和Western blotting法檢測，觀察ELB對疲勞小鼠學習記憶功能的影響，并探討其相關(guān)機制，為刺五加活性成分的利用和相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)奠定理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器60只雄性ICR小鼠(吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司)，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(吉)-2018-0007，體質(zhì)量為(20±2)g。ELB(ID：QZ3Y-Y3AD；111574-201605，中國食品藥品檢定研究院)，乳酸(lactic acid,LD)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogebase,LDH)試劑盒、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒和三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphase,ATPase)試劑盒(南京建成生物工程研究院)，活性氧簇(reactive oxygen,ROS)試劑盒、谷氨酸(glutamic acid,GLU)試劑盒、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)試劑盒和γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，BCA蛋白定量測定試劑盒、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)和血紅素加氧酶1(home oxygenase 1,HO-1)(北京鼎盛昌盛生物技術(shù)有限公司)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。MT-200 Morris水迷宮分析儀、BA-200小鼠避暗儀和DT-200小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀(成都泰盟科技有限公司)，Infinite M200型酶標儀(瑞士TECAN集團公司)，低溫高速離心機(美國 Eppendorf 公司)，Western blotting 凝膠電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀 (美國Bio-Red公司)，多色熒光及化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) (北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

1.2 實驗動物分組和給藥方式靜坐實驗：保持小鼠的正常生活，不施加任何外界干擾。游泳實驗：采用游泳實驗制備小鼠疲勞模型，將小鼠置于水深為20 cm的恒溫(20 ℃±2 ℃)水箱中進行游泳實驗，第1天游泳30 min，第2天40 min，從第3天開始每天1 h，共4周。

將60只雄性ICR小鼠隨機分為4組，每組15只。對照組：灌胃給予蒸餾水，靜坐實驗； 模型組：灌胃給予蒸餾水，游泳實驗； ELB(C)組：灌胃給予80 mg·kg-1ELB，靜坐實驗； ELB(M)組：灌胃給予80 mg·kg-1ELB，游泳實驗。每天灌胃1次，共4周。

1.3 轉(zhuǎn)棒實驗末次給藥30 min后，使DT-200小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀保持30 r·min-1的轉(zhuǎn)速，小鼠先進行3次適應訓練后進行正式實驗，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上運動的時間。

1.4 Morris水迷宮實驗末次給藥30 min后開始Morris水迷宮實驗。實驗前，將小鼠置于水迷宮裝置中游泳2 d，保持每天2 min，使各組小鼠適應環(huán)境。定位航行測試：恒溫水池(25℃±2 ℃，r=60 cm，h=50 cm)中放置1個低于水面1 cm的玻璃平臺(r=2.5 cm)，并加入適量二氧化鈦(TiO2)。測試6 d，將小鼠面對水池壁放入恒溫水池中游泳，儀器自動記錄小鼠找到平臺時間。若2 min未上臺，則逃避潛伏期記為120 s。

1.5 避暗實驗末次給藥30 min后，先將小鼠置于BA-200小鼠避暗儀中充分適應環(huán)境，在暗室給予一個5 min的持續(xù)電流，當小鼠進入時將遭受電擊，逃回明室。從實驗開始到小鼠第一次遭受電擊的時間即為避暗潛伏期，最長潛伏期為5 min。記錄小鼠5 min之內(nèi)遭受電擊的總次數(shù)，即為避暗錯誤次數(shù)。

1.6 小鼠血清和腦組織中各生化指標檢測末次給藥30 min后，小鼠眼球取血，離心制備血清。采血后迅速取小鼠腦組織，稱質(zhì)量并用生理鹽水漂洗，備用。采用比色法檢測小鼠血清中LD水平，采用微量酶標法檢測小鼠血清中LDH活性，脲酶法檢測小鼠血清中BUN水平，羥胺法檢測小鼠腦組織中SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)法檢測小鼠腦組織中MDA水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測小鼠腦組織中ROS、eNOS、GABA和GLU水平，分光光度法檢測小鼠腦組織中ATPase活性。血清中LDH活性(U·L-1)=[(測定A值-對照A值)/(標準A值-空白A值)]×標準品濃度×稀釋倍數(shù)×1 000，血清中LD和BUN水平(mmol·L-1)=[(測定A值-空白A值)/(標準A值-空白A值)]×標準品濃度×稀釋倍數(shù)，ATPase活性(μmol Pi·mg-1prot·h-1)=[(測定A值-對照A值)/標準A值]×標準品濃度(0.5 mol·L-1)×反應體系中樣本稀釋倍數(shù)(2.5)×6/勻漿蛋白濃度(g·L-1)。

1.7 Western blotting法檢測小鼠腦組織中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平末次給藥30 min后，取小鼠腦組織在冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清。根據(jù)BCA蛋白定量測定試劑盒具體步驟嚴格操作，測定小鼠腦組織的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離各蛋白，冷水浴中電轉(zhuǎn)膜70 min，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用含5 %脫脂奶粉的TBS-T封閉1 h，棄封閉液，分別加入一抗β-actin、Keap1、Nrf2和HO-1，4 ℃搖床過夜。TBS-T洗膜5次(15 min/次)，加入二抗室溫搖床孵育1 h，TBS-T洗膜5次(15 min/次)，ECL 顯影液顯色。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 HE染色觀察小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)末次給藥30 min后，取小鼠全腦，投入 4% 多聚甲醛中固定，進行冰凍切片，HE 染色按照HE染色試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠轉(zhuǎn)棒時間與對照組比較，模型組小鼠轉(zhuǎn)棒時間明顯縮短(P<0.05)，ELB(C)組小鼠轉(zhuǎn)棒時間延長(P<0.05)；與模型組比較，ELB(M)組小鼠轉(zhuǎn)棒時間明顯延長(P<0.05)，且各組小鼠第2天的轉(zhuǎn)棒時間均較第1天延長。見表1。

表1 各組小鼠的轉(zhuǎn)棒時間

2.2 各組小鼠逃避潛伏期定位航行實驗結(jié)果顯示：各組小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)隨著訓練天數(shù)的增加而逐漸縮短。在實驗第5和6天，與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，ELB(C)組小鼠逃避潛伏期縮短，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，實驗第6天ELB(M)組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見圖1。

*P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs model group.

2.3 各組小鼠避暗潛伏期和錯誤次數(shù)各組小鼠避暗潛伏期隨著時間的增加有不同程度的延長。與對照組比較，模型組小鼠避暗潛伏期縮短(P<0.05)，ELB(C)組小鼠避暗潛伏期延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，ELB(M)組小鼠避暗潛伏期明顯延長(P<0.05)。各組小鼠避暗錯誤次數(shù)隨著時間的延長均有不同程度的減少。與對照組比較，模型組小鼠5 min內(nèi)避暗錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.05)，ELB(C)組小鼠避暗錯誤次數(shù)減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，ELB(M)組小鼠避暗錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠避暗實驗中避暗潛伏期和錯誤次數(shù)

2.4 各組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平與對照組比較，模型組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平明顯升高(P<0.05)；ELB(C)組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中LDH活性和 LD及BUN水平

2.5 各組小鼠腦組織中SOD活性及MDA、ROS、eNOS水平和GLU/GABA比值與對照組比較，模型組小鼠腦組織中SOD活性、eNOS水平和GLU/GABA比值降低(P<0.05)，MDA和ROS水平升高(P<0.05)；ELB(C)組小鼠腦組織中SOD活性、eNOS水平和GLU/GABA比值升高，MDA和ROS水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織中SOD活性、eNOS水平和GLU/GABA比值升高(P<0.05)，MDA和ROS水平降低(P<0.05)。見表4。

2.6 各組小鼠腦組織中ATPase活性與對照組比較，模型組小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性降低(P<0.05)；ELB(C)組小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性升高(P<0.05)。見表5。

表4 各組小鼠腦組織中各項生化指標

表5 各組小鼠腦組織中ATPase活性

2.7 Western blotting法檢測各組小鼠腦組織中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平與對照組比較，模型組小鼠腦組織中Keap1蛋白表達水平升高(P<0.05)，Nrf2和HO-1蛋白表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織中Keap1蛋白表達水平降低(P<0.05)，Nrf2和HO-1蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖2和表6。

2.8 各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組小鼠腦組織海馬區(qū)椎體細胞排列緊密有序，大小均勻，細胞核和細胞質(zhì)清晰可見；模型組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列松散，層次不清，間隙增大，部分海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)有明顯的病理學改變；與對照組比較，ELB(C)組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增多，層次清晰，排列較為緊密有序，細胞形態(tài)均一；與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列更緊密有序，間隙減少，層次更加清晰，細胞形態(tài)和體積趨于正常。見圖3(插頁六)。

Lane 1：Control group；Lane 2：Model group；Lane 3：ELB(C) group；Lane 4：ELB(M) group.

表6 各組小鼠腦組織中 Keap1、Nrf2和HO-1 蛋白表達水平

3 討 論

超過耐受量的劇烈運動會產(chǎn)生明顯的運動性疲勞，這時機體由有氧供能變成無氧糖酵解，使LD在體內(nèi)積累，蛋白質(zhì)分解加強，體內(nèi)BUN水平升高，導致肌肉酸痛，使機體產(chǎn)生疲勞感同時運動耐力降低，而血清中 LDH水平反映機體運動肌肉損傷的程度[10-11]。本研究通過游泳實驗建立了運動性疲勞小鼠模型，采用轉(zhuǎn)棒實驗觀察小鼠的運動耐力情況，結(jié)果顯示：模型組小鼠轉(zhuǎn)棒時間明顯縮短，表明疲勞小鼠模型建立成功；與模型組比較，給予ELB干預后，疲勞小鼠血清中LD水平、LDH活性和BUN水平降低，提示ELB可加快LD的代謝，有效緩解疲勞。

疲勞可以引起機體神經(jīng)系統(tǒng)機能和抗氧化功能改變，從而使學習記憶力降低[12-13]。疲勞時體內(nèi)自由基不能得到有效清除，ROS積累在引起神經(jīng)元損傷并導致認知功能障礙的同時，也造成eNOS 脫偶聯(lián)，NO 水平下降和氧自由基水平升高，致使具有抗氧化作用的自由基清除酶SOD 活性降低，反映自由基損傷的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高等[14-17]。本研究結(jié)果顯示：疲勞模型小鼠水迷宮潛伏期延長，避暗潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加，小鼠腦組織中SOD活性和eNOS水平降低，MDA和ROS水平升高，說明疲勞小鼠處于氧化應激狀態(tài)，且出現(xiàn)認知功能障礙；ELB干預后，疲勞小鼠水迷宮實驗潛伏期縮短，避暗潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少，小鼠腦組織中SOD活性和eNOS水平升高，MDA和ROS水平降低，說明ELB可有效增強疲勞小鼠抗氧化能力。疲勞小鼠體內(nèi)ROS水平降低，則會使腦組織線粒體Ca2+內(nèi)流減少，線粒體內(nèi)ATPase的活性增高，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學習記憶相關(guān)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)GLU及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的比值升高[18-20]，可降低腦內(nèi)神經(jīng)元損傷及受體功能障礙，改善疲勞小鼠的學習記憶能力。在本研究中，給予ELB干預后，疲勞小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性及GLU/GABA比值均升高，小鼠海馬區(qū)結(jié)構(gòu)層次清晰，排列較為緊密有序，提示ELB可以通過降低細胞氧化應激損傷，增強機體抗氧化作用，從而改善疲勞小鼠的學習記憶能力。

在細胞氧化應激反應中，Nrf2是關(guān)鍵因子，Keap1是Nrf2的負調(diào)節(jié)因子，正常情況下Keap1會與Nrf2在細胞漿結(jié)合，維持細胞質(zhì)中Nrf2的穩(wěn)定，當細胞處于氧化應激環(huán)境中時，Keap1與Nrf2解偶聯(lián)，活化的Nrf2會進入細胞核與抗氧化反應元件ARE相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和編碼細胞內(nèi)解毒酶的表達，保護細胞[21-24]。而HO-1是Nrf2/ARE通路調(diào)控的重要抗氧化酶，受Nrf2調(diào)控。本研究結(jié)果顯示：ELB干預后，疲勞小鼠腦組織中Keap1蛋白表達水平降低， Nrf2和HO-1蛋白表達水平升高，說明ELB改善疲勞小鼠的氧化應激狀態(tài)與調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。

綜上所述，ELB能夠改善疲勞小鼠的學習記憶能力，增強機體抗氧化能力，具體機制可能與其調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號通路的相關(guān)因子表達有關(guān)。本研究為刺五加的開發(fā)和利用奠定了理論和實踐基礎(chǔ)。