卜 一，張 碩，錢旭東，王紅梅，竇志杰

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 承德 067000)

缺血性腦血管病致殘率和死亡率高，對人類健康造成嚴重危害。腦梗死后新生血管形成可為缺血腦組織供血供氧，縮小梗死灶體積，減少神經(jīng)細胞損傷，并有助于神經(jīng)功能恢復[1]。血管生成受多種血管生成因子調(diào)節(jié)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor-binding protein 3,IGFBP-3)與血管生成關系密切，在不同疾病中IGFBP-3發(fā)揮作用也不同，在不同疾病中IGFBP-3可具有促進血管生成和抑制血管生成作用。KUSHLINSKII等[2]研究發(fā)現(xiàn)：大腸癌患者血清中IGFBP3水平與VEGF表達水平呈負相關關系，可能發(fā)揮抑制血管新生的作用；BAKOPOULOU等[3]研究認為：IGFBP3具有促血管生成的作用。但IGFBP-3在腦梗死組織中的表達情況及其與腦梗死后血管生成的關系尚不清楚。本研究旨在深入探討腦梗死大鼠缺血腦組織中IGFBP-3表達水平及其與血管新生的關系，闡明IGFBP-3在腦梗死血管新生中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器健康、清潔級SD大鼠110只，購自北京市醫(yī)療器械檢驗所，動物使用許可證號：SYXK(京)2015-0005。ECL發(fā)光液、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、BCA試劑盒和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美國Bioworld公司)，TRIzol和水合氯醛(上海碧云天生物技術公司)，兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體、兔抗鼠CD31多克隆抗體和兔抗鼠α-SMA多克隆抗體等抗體(美國Santa Cruz公司)。RT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 大鼠分組和模型建立將110只大鼠分為對照組30只和模型組80只。模型組大鼠采用LONGA等[4]線栓法建立大腦中動脈栓塞缺血大鼠模型：水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定到動物手術臺上，取頸正中切口，切開皮膚、淺筋膜，分離肌肉，暴露左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，雙重結(jié)扎頸外動脈及其分支，在頸外動脈近分叉處做小切口，從雙重結(jié)中間切斷頸外動脈，插入漁線，使?jié)O線繞過頸總動脈分支，進入頸內(nèi)動脈，向顱內(nèi)方向推進，推進長度約18 mm，微遇阻力時停止，將線栓阻斷在大腦中動脈起始處，加固結(jié)扎頸外動脈，防止線栓滑脫，縫合皮膚，阻斷血流2 h；在麻醉狀態(tài)下輕拉線栓，使其頭端回到頸外動脈內(nèi)，實現(xiàn)再灌注。對照組大鼠不結(jié)扎不插線，其余步驟同模型組。模型組大鼠術后24 h采用神經(jīng)功能評分法[4]進行神經(jīng)行為學評價，評分1～3分者納入研究，評分0分和4分者予以剔除。對照組大鼠無死亡。模型組大鼠死亡7只，神經(jīng)功能評分0分者2只，4分者1只，均予以剔除，納入研究70只。對照組和模型組各取10只大鼠用于TTC染色。模型組剩余60只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為模型1 d組、模型3 d組和模型7 d組，每組20只，分別于術后1、3和7 d處死。

1.3 神經(jīng)行為學評分評估大鼠神經(jīng)行為術后24 h進行神經(jīng)行為學評分：無神經(jīng)缺損癥狀為0分；缺血對側(cè)前肢不能完全伸展為1分；行走時向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時向缺血對側(cè)傾倒為3分；意識受到抑制、不能行走為4分；死亡為5分。評分1～3分為建模成功。

1.4 標本采集和處理神經(jīng)行為學評分后，對照組和模型組各取10只大鼠，過量麻醉處死大鼠，迅速斷頭取腦，用于TTC染色。對照組、模型1 d組、模型3 d組和模型7 d組各取10只大鼠，深度麻醉后，經(jīng)心臟注射生理鹽水，然后注射多聚甲醛，至大鼠全身僵硬，四肢微顫，取出大腦，置多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后，進行冠狀切片，切片厚4 μm，用于HE染色、免疫組織化學染色和免疫熒光染色。對照組、模型1 d組、模型3 d組和模型7 d組各取剩余10只大鼠，深度麻醉后，冰上斷頭取腦，投入液氮中冷凍，用于RT-PCR法檢測。

1.5 大鼠腦組織TTC染色觀察腦梗死情況將新鮮腦組織冰凍30 min，切成厚2 mm切片，置于TTC中孵育15 min，每5 min翻動1次切片，染成紅色者為正常腦組織，染成白色者為梗死組織，染色后將腦組織切片置于多聚甲醛中過夜浸泡，采用Image J軟件測定腦組織梗死面積，計算腦梗死體積。

1.6 HE染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)將大鼠腦組織切片室溫下風干。蘇木素染色60 s，自來水沖洗10 s，鹽酸乙醇處理2 s，自來水沖洗2 s，氨水返藍10 s，自來水沖洗15 s，脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察腦組織中神經(jīng)細胞壞死及血管水腫等情況。

1.7 免疫組織化學染色檢測大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF蛋白表達水平取腦組織切片晾干，過氧化氫孵育10 min，檸檬酸水微波爐中加熱10 min，加入TritonX-100孵育30 min，加入一抗：兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠VEGF多克隆抗體(1∶200)，過夜孵育，空白對照組以PBS代替一抗，加入二抗(1∶500)孵育30 min，DAB顯色，常規(guī)復染、脫水、封片。顯微鏡下觀察：細胞漿出現(xiàn)棕黃色為IGFBP-3、VEGF陽性細胞，采用IPP 6.0軟件檢測陽性細胞的積分光密度(IOD)值，以IOD值代表目的蛋白表達水平。

1.8 RT-PCR法檢測大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平取100 g大鼠腦組織勻漿，加入TRIzol和氯仿提取腦組織中RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對cDNA進行PCR擴增，PCR反應條件：94℃、2 min；94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、2 min，共38個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平。引物序列見表1。

1.9 免疫熒光染色檢測大鼠腦組織中缺血半暗區(qū)微血管密度取大鼠腦組織切片，PBS清洗，PBST破膜20 min，加入BSA封閉1 h，加入一抗兔抗鼠CD31多克隆抗體(1∶200)過夜孵育，PBS清洗，加入熒光二抗(1∶500)孵育2 h，PBS清洗；加入一抗兔抗鼠α-SMA多克隆抗體(1∶200)過夜孵育，PBS清洗，加入熒光二抗(1∶500)孵育2 h。采用Image-Pro Plus軟件對圖像進行處理。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠行為表現(xiàn)和神經(jīng)行為評分對照組大鼠無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；模型組大鼠出現(xiàn)進食少、活動少和反應遲鈍等表現(xiàn)及對側(cè)前肢屈曲、向外側(cè)轉(zhuǎn)圈、同側(cè)霍納征、行走時向?qū)?cè)傾倒等偏癱體征。對照組大鼠神經(jīng)行為學評分0分，模型組大鼠24 h神經(jīng)行為學評分(1.86±0.73)分。

2.2 2組大鼠腦組織TTC染色對照組大鼠腦組織紅染，無白色梗死灶出現(xiàn)。24 h后模型組大鼠腦組織均出現(xiàn)白色梗死灶，腦組織水腫明顯，梗死灶主要位于紋狀體和皮層區(qū)，腦梗死體積為(28.34±3.57)%。見圖1(插頁四)。

2.3 各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠腦組織神經(jīng)細胞、毛細血管形態(tài)均正常，結(jié)構(gòu)完整，胞漿無紅染，結(jié)構(gòu)完整，無神經(jīng)細胞變性壞死。模型1 d組大鼠腦組織缺血區(qū)神經(jīng)細胞腫脹、結(jié)構(gòu)模糊、間質(zhì)水腫，出現(xiàn)細胞皺縮、核深染，毛細血管出現(xiàn)輕度水腫；模型3 d組大鼠腦組織缺血區(qū)神經(jīng)細胞皺縮，細胞和細胞間質(zhì)明顯水腫，組織間隙增寬，出現(xiàn)明顯空泡化，毛細血管中度水腫；模型7 d組大鼠腦組織缺血區(qū)神經(jīng)細胞壞死，細胞和細胞間質(zhì)水腫減輕，血管水腫減輕。見圖2(插頁五)。

2.4 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF免疫組織化學染色結(jié)果及蛋白表達水平對照組大鼠腦組織見少量IGFBP-3弱陽性細胞和少量VEGF陽性細胞。不同時間模型組大鼠腦組織中均有IGFBP-3和VEGF陽性表達，模型3 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF陽性表達最強，模型7 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF陽性表達減弱。見圖3(插頁五)和圖4(插頁五)。與對照組比較，不同時間模型組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01)；模型3 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達水平最高，模型7 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達水平較模型3 d組有所降低。見表2。

2.5 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平與對照組比較，不同時間模型組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05)，模型3 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平最高，模型7 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平較模型3 d組有所降低。見表3。

表2 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達水平

表3 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達水平

2.6 各組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度選擇CD31和α-SMA分別作為內(nèi)皮細胞和周細胞標記物，對腦缺血半暗區(qū)進行免疫熒光染色，觀察微血管密度。與對照組比較，不同時間模型組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度均升高(P<0.01)，模型3 d組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度最高，模型7 d組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度較模型3 d組有所降低。見圖5(插頁五)和表4。

表4 各組大鼠腦組織中缺血半暗區(qū)微血管密度

2.7 大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達水平與VEGF mRNA表達水平和微血管密度的相關性分析大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達水平與VEGF mRNA表達水平和微血管密度均呈正相關關系(r=0.563，P<0.05；r=0.612，P<0.05)。

3 討 論

胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)信號系統(tǒng)在細胞增殖、分化、凋亡、遷移和血管生成等方面均發(fā)揮重要作用。IGF信號系統(tǒng)由IGF配體、IGF受體和IGFBPs組成，IGFBPs包括IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6，IGFBPs與IGF具有較高的親和力，在IGF生物活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。在上述6種結(jié)合蛋白中，IGFBP-3與惡性腫瘤關系密切，因此成為研究的熱點[6]。IGFBP-3在多種惡性腫瘤中表達異常，具有抗腫瘤作用[7]。IGFBP-3在缺血再灌注損傷中表達也存在異常，如大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注后IGFBP-3表達先升高后降低[8]，IGFBP-3可能為缺血狀態(tài)下的一種生理反應。本研究結(jié)果顯示：腦梗死大鼠神經(jīng)功能評分升高，并出現(xiàn)腦梗死灶，表明腦梗死模型建立成功；HE染色結(jié)果顯示：大鼠腦梗死3 d時腦損傷最嚴重，腦梗死7 d時有所恢復；大鼠腦組織中IGFBP-3蛋白和mRNA表達水平在腦梗死3 d時最高，腦梗死7 d時有所降低，表明IGFBP-3可能參與腦梗死的缺血再灌注過程。

急性腦梗死后缺血核心區(qū)神經(jīng)細胞發(fā)生變性壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能不可逆性損傷，而梗死早期周圍缺血半暗區(qū)神經(jīng)細胞可存活一定時間，因此盡快建立側(cè)支循環(huán)、改善梗死灶周圍缺血半暗區(qū)供血和挽救瀕死神經(jīng)細胞對減輕腦梗死損傷和改善預后具有重要價值。腦梗死后血管新生受多種細胞外基質(zhì)、細胞分子和黏附因子等影響[9-10]。IGFBP-3和血管形成的關系也比較密切，IGFBP-3在不同疾病中對血管形成的作用不同，具有抑制血管形成和促進血管形成的雙重作用。如IGFBP-3是人血清中一種主要的IGF結(jié)合蛋白，通過IGF依賴性和IGF非依賴性機制方式調(diào)節(jié)人頭頸部鱗狀細胞癌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管生成活性，其可通過阻斷整合素介導的腫瘤和血管內(nèi)皮細胞的黏附活性進而抑制血管生成和惡性腫瘤的發(fā)展[11]；在胰腺癌細胞中上調(diào)IGFBP-3水平具有抗腫瘤血管形成的作用[12]；類風濕性關節(jié)炎患者血清IGFBP-3水平升高，IGF-I和IGFBP-3在類風濕性關節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮誘導血管生成的作用[13]；ANGUIANO-HERNANDEZ等[14]研究發(fā)現(xiàn)：IGFBP-3水平升高與血管生成增加有關。

本文作者對腦梗死大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達水平與血管形成的關系進行研究，采用CD31/αSMA共同標志微血管密度，結(jié)果顯示：腦梗死大鼠腦組織中微血管密度升高，腦組織中IGFBP-3 mRNA表達水平與VEGF mRNA表達水平和微血管密度呈正相關關系，表明IGFBP-3可能通過促進血管形成參與腦梗死后缺血再灌注損傷過程。VEGF與血管發(fā)生和生長關系密切，是一種特異性內(nèi)皮細胞有絲分裂原，可誘導血管生成、促進內(nèi)皮細胞生長和增加血管通透性[15]。VEGF促進血管生成的作用：誘導內(nèi)皮細胞上表達相應配體和受體[16]；促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移；增加血管細胞黏附分子和細胞間黏附分子水平；促進內(nèi)皮細胞表面表達整合素受體；增加絲氨酸蛋白酶活性，降解細胞外基質(zhì)，從而促進血管生成[17-18]。IGFBP-3在多種疾病中與VEGF關系密切，可與VEGF共同參與多種疾病的發(fā)病過程[19-21]，如下調(diào)VEGF后可抑制小鼠子宮IGFBP-3表達[22]。本研究結(jié)果顯示：腦梗死大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達水平與VEGF mRNA表達水平呈正相關關系，表明IGFBP-3可能通過與VEGF相互作用，促進VEGF表達進而促進新生血管生成。

綜上所述，腦梗死大鼠腦組織中IGFBP-3表達水平升高，其變化趨勢與腦組織中VEGF和微血管密度一致，IGFBP-3可能在腦梗死后新生血管形成中發(fā)揮重要作用。