梁瑞鵬，程 倩，陸春花，李 可，于恒恒，徐 彬，袁順杰，劉維薇，林 清

乳腺癌是女性最常診斷的惡性腫瘤之一，近年來(lái)無(wú)論是發(fā)病率還是致死率均高居首位[1]。眾所周知，乳腺癌是一組高度異質(zhì)性疾病，雌激素受體(estrogen receptor；ER)陽(yáng)性乳腺癌約占所有乳腺癌70%，在乳腺癌患者占有較大比例。A型激酶錨定蛋白12(A kinase-anchored protein 12；AKAP12)是胞內(nèi)大分子支架蛋白與維持正常組織結(jié)構(gòu)功能完整[2]及腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移[3]等過(guò)程密切相關(guān)。AKAP12最早被用來(lái)評(píng)價(jià)重癥肌無(wú)力預(yù)后的抗原，隨后研究[4]發(fā)現(xiàn)在src基因、ras基因等原癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中AKAP12表達(dá)明顯下調(diào)，文獻(xiàn)[5]報(bào)道，與正常組織相比，AKAP12在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如實(shí)體腫瘤肺癌、結(jié)直腸癌[3]、肝癌[6]，血液腫瘤如幼年髓單核細(xì)胞白血病[7]，在腫瘤細(xì)胞重新表達(dá)AKAP12抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲，而干擾AKAP12則增加腫瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力，因此AKAP12被認(rèn)為是潛在的抑癌基因。但AKAP12與乳腺癌生物學(xué)功能是否有關(guān)尚未闡明，AKAP12是否參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有待于研究。該研究通過(guò)干擾ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AKAP12表達(dá)來(lái)觀察其對(duì)ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞增殖、周期機(jī)制的影響，初步探討AKAP12在ER陽(yáng)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3以及乳腺正常上皮細(xì)胞MCF-10A均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；特異性干擾AKAP12基因的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自hyclone公司；CCK-8試劑購(gòu)自上海諾維贊生物科技公司；RIPA裂解液(強(qiáng))、蛋白酶抑制劑PMSF購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人AKAP12單克隆抗體購(gòu)自abcam公司；β-actin鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自proteintech公司；兔抗人P21抗體、兔抗人P27抗體以及鼠抗人CyclinD1抗體均購(gòu)自proteintech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱；接種細(xì)胞于六孔板待貼壁穩(wěn)定，更換1 ml不含雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基和40 μl病毒感染增強(qiáng)液(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，按照1 ∶10的MOI值加入病毒液，24 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡下看細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光)，更換含有5 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行藥物篩選。

1.3 Western blot檢測(cè)蛋白量收集細(xì)胞添加適量細(xì)胞裂解液(按照1 ∶100加入蛋白酶抑制劑)，冰上裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液使用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，按照20 μg上樣檢測(cè)，80 V恒壓電泳，電泳結(jié)束后采用 200 mA 恒流低溫轉(zhuǎn)膜至NC膜(AKAP12轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h)，室溫5%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗4 ℃孵育12 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min。掃膜讀取條帶并測(cè)量條帶灰度值。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，按照4 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪設(shè)于96孔板中，分別在24、48、72 h檢測(cè)結(jié)果。添加CCK8試劑后2 h后于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀值。

1.5 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，按照2 000個(gè)每孔鋪設(shè)于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后，70%酒精固定，0.1%結(jié)晶紫染色晾干鏡下計(jì)數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)一個(gè)克隆。

1.6 生信網(wǎng)站分析乳腺癌中AKAP12表達(dá)與生存曲線使用乳腺癌數(shù)據(jù)網(wǎng)站Miner v4.1(bcGenExMiner v4.1)評(píng)估不同分子亞型乳腺癌中AKAP12表達(dá)情況和生存曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 不同分子亞型乳腺癌AKAP12表達(dá)情況及乳腺癌Luminal A型高表達(dá)AKAP12生存愈后較好使用乳腺癌信息網(wǎng)站(http://bcgenex.centregauducheau.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1)分析AKAP12表達(dá)量與乳腺癌分子分型、預(yù)后相關(guān)信息[8]，結(jié)果顯示如圖1，各分子亞型乳腺癌AKAP12 mRNA水平明顯均低于正常組織(P<0.000 1)，且AKAP12在各個(gè)乳腺癌亞型的相對(duì)表達(dá)情況在不同分子分型存在差異；生存曲線顯示，Luminal A型乳腺癌患者較高的AKAP12代表較好的生存愈后(P<0.05)。

圖1 不同分子分型乳腺癌AKAP12表達(dá)情況及乳腺癌 Luminal A型高表達(dá)AKAP12生存愈后較好

2.2 AKAP12蛋白在各個(gè)分子分型乳腺癌細(xì)胞以及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的表達(dá)水平選取實(shí)驗(yàn)室常用各個(gè)分子分型乳腺癌細(xì)胞株以及人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，檢測(cè)其AKAP12表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖2)，與正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A比較，各分子亞型乳腺癌細(xì)胞株明顯低表達(dá)AKAP12，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)值分別是19.00、16.01、13.61和21.89)，提示AKAP12的丟失或與乳腺癌發(fā)生相關(guān)。

圖2 AKAP12在各個(gè)分子亞型乳腺癌細(xì)胞以及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的表達(dá)水平

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞及Western blot檢測(cè)AKAP12蛋白表達(dá)細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，Western blot檢測(cè)AKAP12蛋白水平的變化，檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，與空載體對(duì)照組比較，shRNA-AKAP12細(xì)胞AKAP12蛋白表達(dá)下調(diào)，兩組細(xì)胞AKAP12蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，F(xiàn)=1.857)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 AKAP12對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響采用CCK-8增殖檢測(cè)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AKAP12對(duì)MCF-7增殖能力的影響，72 h內(nèi)CCK-8檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4A)，與對(duì)照組相比，shRNA-AKAP12細(xì)胞表現(xiàn)出增殖速率加快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，F(xiàn)=1.778)；細(xì)胞克隆形成是檢驗(yàn)單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)獨(dú)立集落的能力，反映細(xì)胞增殖活力和持續(xù)增殖的能力，克隆形成結(jié)果顯示(圖4B、4C)，MCF-7細(xì)胞干擾AKAP12表達(dá)后表現(xiàn)為細(xì)胞克隆形成多于相應(yīng)空載體組，且克隆形成體積明顯大于空載體組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)=2.011)。綜上，干擾AKAP12表達(dá)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖能力，AKAP12或是其潛在的抑癌基因。

圖3 干擾AKAP12基因后MCF-7細(xì)胞AKAP12蛋白的表達(dá)水平

圖4 干擾AKAP12增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞增殖能力

2.5 干擾AKAP12表達(dá)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞G1/S期進(jìn)展干擾MCF-7細(xì)胞AKAP12表達(dá)后，Western blot檢測(cè)調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白表達(dá)變化，檢測(cè)結(jié)果顯示抑制G1/S期轉(zhuǎn)換的P27、P21蛋白表達(dá)下調(diào)，尤其是P21蛋白，然而促進(jìn)G1/S期進(jìn)展的CyclinD1蛋白則表達(dá)上調(diào)。干擾AKAP12表達(dá)后增加MCF-7細(xì)胞的增殖能力，加快腫瘤細(xì)胞周期(G1/S期)進(jìn)展是其機(jī)制之一。見(jiàn)圖5。

圖5 干擾AKAP12表達(dá)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞G1/S期進(jìn)展

3 討論

腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖和凋亡受阻是其惡性行為及難于治療的原因之一。AKAP12與腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)系密切：過(guò)表達(dá)miR-103通過(guò)抑制AKAP12表達(dá)增加PKC活性進(jìn)而增加端粒酶活性促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[6]，抑制miR-103通過(guò)增加AKAP12表達(dá)進(jìn)而可阻止端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核轉(zhuǎn)位和磷酸化，降低肝細(xì)胞肝癌HCC細(xì)胞中的端粒酶活性從而抑制增殖并促進(jìn)HCC細(xì)胞的凋亡，非小細(xì)胞肺癌中TFAP2C通過(guò)誘導(dǎo)致癌miR-103的過(guò)表達(dá)阻斷AKAP12介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D1抑制進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖[5]，纖維肉瘤HT1080細(xì)胞[9]研究中AKAP12誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與Bcl-2的表達(dá)降低和Bax的表達(dá)增加有關(guān)，并且降低Cyclin D1表達(dá)水平且阻滯其核定位，引起細(xì)胞周期阻滯。Liu et al[10]在結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞重表達(dá)AKAP12發(fā)現(xiàn)明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并顯著增加cleaved-capase3水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，AKAP12抑制腫瘤細(xì)胞增殖或通過(guò)控制細(xì)胞周期進(jìn)展和促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。但也有研究通過(guò)臨床結(jié)直腸癌病例樣本免疫組化染色并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AKAP12與Bcl-2及P53存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11]，以及三陰性乳腺癌細(xì)胞Hs578T細(xì)胞中敲除AKAP12誘導(dǎo)細(xì)胞遷移能力增加[12]，但不影響細(xì)胞增殖凋亡。最初在大鼠MAT-LyLu(MLL)前列腺癌細(xì)胞中證實(shí)了AKAP12具有轉(zhuǎn)移抑制潛能， AKAP12重表達(dá)對(duì)原發(fā)部位腫瘤的生長(zhǎng)影響甚微，但是明顯減少了肉眼可見(jiàn)肺部轉(zhuǎn)移，提示AKAP12發(fā)揮抑癌基因作用抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移侵襲。但在黑色素瘤的研究中[13]，相較于正常皮膚，原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移樣本均具有較高水平AKAP12 變體2表達(dá)，降低AKAP12 v2通過(guò)減少蛋白激酶A(PKA)調(diào)節(jié)的磷酸化減少黑色素瘤的遷移和侵襲，研究結(jié)果支持AKAP12 v2及其支架功能的存在對(duì)于體外轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲是必要的，且較高表達(dá)AKAP12與不良生存相關(guān)，在對(duì)胃癌研究中[14]，基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析AKAP12在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義，研究認(rèn)為高表達(dá)AKAP12預(yù)示著不良的愈后，這也提示AKAP12作為胞內(nèi)大分子支架蛋白通過(guò)錨定不同信號(hào)分子在腫瘤中存在復(fù)雜機(jī)制有待研究。

AKAP12在乳腺癌的研究鮮有報(bào)道。本研究顯示AKAP12在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示正常乳腺組織中丟失AKAP12或與乳腺癌發(fā)生有關(guān)；ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞相對(duì)于其他分子分型細(xì)胞株高表達(dá)AKAP12，這與Soh et al[12]研究存在差異，Soh et al[12]認(rèn)為三陰性乳腺癌細(xì)胞AKAP12表達(dá)高于其他分子亞型。研究通過(guò)在MCF-7細(xì)胞干擾AKAP12基因后觀察細(xì)胞增殖、遷移侵襲等表型變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AKAP12與MCF-7細(xì)胞增殖關(guān)系密切，干擾AKAP12則增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞增殖能力，同時(shí)，研究也進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)MCF-7親本株細(xì)胞及干擾AKAP12后細(xì)胞侵襲能力的變化，但未見(jiàn)到細(xì)胞穿過(guò)基底膜(數(shù)據(jù)未列出)。綜上，本研究表明干擾AKAP12增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力，與AKAP12調(diào)控細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換相關(guān)。