李俊茹， 胡 菊， 馮 彩， 崔長海， 王良炎

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

草金魚（Carassius auratus），又稱金鯽魚或正彩鯽，是金魚的原始類型，體形近似鯽魚，是鯽魚的一個(gè)變種，屬鯉形目、鯉科、鯽屬，具有觀賞、食用等作用。另外，還可作為金龍魚、銀龍魚等高檔觀賞魚的餌料魚，市場需求量較大[1]。

四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）是墨蝶呤經(jīng)墨蝶呤還原酶（sepiapterin reductase，SPR）及二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）催化后生成，然后生成黃色或紅色的蝶啶色素顆粒[2]。研究發(fā)現(xiàn)，spr的多態(tài)性與爬行動(dòng)物壁虎的橙色體色有著重要關(guān)聯(lián)[2]，另外，在青鳉鱗片不同種類色素細(xì)胞中，spr基因的定位也具有顯著差異[3]，spr表達(dá)量在斑馬魚發(fā)育過程中隨著黃色素細(xì)胞的增多而升高[4]。目前spr在草金魚等其他觀賞魚類中的研究未見報(bào)道。本研究以草金魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過半定量方法探究spr與體色形成的關(guān)系，從而為研究草金魚體色形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)對(duì)象所用草金魚取自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。丁香酚麻醉后，分別對(duì)純紅、純白、純黃和純黑草金魚背部鱗片即紅鱗、白鱗、黃鱗和黑鱗進(jìn)行取材，鱗片浸入加有RNAlaterRTissue Collection（Thermo Fisher公司，美國）的1.5 mL滅菌EP管中，4 ℃過夜后放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取、定量及完整性檢測

按照RNAiso Plus試劑（TaKaRa公司，大連）說明書步驟提取不同顏色草金魚鱗片總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳及紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測提取的RNA完整性。每個(gè)樣品取1 μL RNA，ND-2000核酸蛋白儀檢測RNA濃度和OD值，判斷其純度。

1.3 cDNA第一鏈合成

參照PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，大連）進(jìn)行樣品cDNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存，用于半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

1.4 spr及內(nèi)參基因β-actin的PCR擴(kuò)增

根據(jù)定量PCR引物設(shè)計(jì)原則以及鯉科魚類spr基因CDS區(qū)，通過Primer Plus 3.0（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）在線網(wǎng)站，設(shè)計(jì)spr特異性定量引物，β-actin為內(nèi)參基因，引物送上海生工合成，引物信息見表1。

經(jīng)過對(duì)引物核苷酸序列及不同退火溫度下PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分析，spr基因片斷擴(kuò)增的最佳退火溫度為58 ℃；β-actin基因片斷擴(kuò)增的最佳退火溫度為60 ℃。

spr和β-actin基因的PCR反應(yīng)采用20 μL體系，分別加入4 μL不同顏色草金魚鱗片cDNA，10 μL Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye），上下游引物各0.6 μL（濃度為1μmol/L），加ddH2O至20 μL。反應(yīng)在Perkin-Elmer 9600熱循環(huán)儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。所有樣品分別取3次，進(jìn)行3次半定量RT-PCR分析，相同結(jié)果達(dá)到2次以上，以保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。

表1 spr PCR引物序列Tab.1 spr PCR primer sequence

1.5 電泳圖片的獲得與定量分析

PCR產(chǎn)物采用EB染色，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照，并用Immage Master VDS Software分析軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析。spr基因相對(duì)表達(dá)量以spr電泳條帶的IOD（Integrated Optical Density）值與β-actin電泳條帶的IOD值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

提取的不同顏色草金魚鱗片總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），觀測到清晰的28s、18s rRNA條帶以及模糊的5s rRNA條帶，28s條帶為18s rRNA條帶亮度的2倍，表明RNA完整性較好。ND-2000核酸蛋白儀檢測RNA濃度和OD值，一般以1.8＜OD260/OD280（Ratio，R）＜2.0為標(biāo)準(zhǔn)，以保證RNA質(zhì)量，合格RNA-80 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，通過內(nèi)參基因β-actin驗(yàn)證（圖2-A），觀測到單一的條帶并放于-80 ℃?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為1 μg，保證了反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達(dá)到良好的平行性，以確保半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)的一致性，提高半定量結(jié)果的可靠性。

2.2 spr基因在不同顏色草金魚鱗片中的表達(dá)

不同顏色草金魚鱗片中spr基因表達(dá)情況（圖2）。本試驗(yàn)對(duì)spr和β-actin分別進(jìn)行了不同顏色鱗片cDNA模板擴(kuò)增的PCR反應(yīng)，檢測結(jié)果（圖2-A）顯示，spr基因在紅色、白色、黃色、黑色鱗片中均有表達(dá)，spr基因的PCR產(chǎn)物電泳條帶亮度在黑色鱗片、黃色鱗片、紅色鱗片中逐級(jí)減弱，以在白色鱗片中最弱，用軟件Immage Master VDS Software對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析也得到了相同的結(jié)果，見圖2-B。

3 討論

草金魚是一種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值、觀賞價(jià)值的魚類，但目前草金魚體色的研究多集中在外部因素上，比如飼料成分、著色劑和飼料添加劑等對(duì)體色的影響，另外在草金魚體色保存方面也有研究，但關(guān)于遺傳因素對(duì)草金魚體色影響的研究較少。蝶啶代謝通路是魚類調(diào)控體色變化的一條重要代謝通路，SPR是其中的一種醛酮還原酶，以NADPH為輔酶催化蝶呤衍生物代謝。在催化BH4合成途徑中，SPR是最后一步反應(yīng)的必需酶[5]。同時(shí)，在補(bǔ)救途徑中，SPR在催化SP分解及BH4合成中也扮演著重要的角色[2]。

關(guān)于青鳉的研究顯示，SPR存在于黃色、黑色鱗片上的色素細(xì)胞中[4]，在金魚的研究中發(fā)現(xiàn)，金魚黑色素細(xì)胞中蝶啶的含量高于紅色素細(xì)胞[6]，而spr基因表達(dá)水平可間接反映細(xì)胞內(nèi)蝶啶含量。純黑草金魚鱗片具有黑色素細(xì)胞，純紅、純黃草金魚鱗片具有紅/黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞，純白草金魚鱗片以虹彩細(xì)胞為主。研究結(jié)果顯示，spr基因在黑色、紅色、黃色鱗片中有較高表達(dá)，可能與這三種體色草金魚鱗片包含的色素細(xì)胞種類有關(guān)即黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞，這三種色素細(xì)胞均含有蝶啶，而spr的高表達(dá)保證了蝶啶的合成[7]。而spr基因在黑色鱗片中表達(dá)量最高，可能是黑色素細(xì)胞中蝶啶的含量相對(duì)于其他色素細(xì)胞較多有關(guān)，這與在金魚[6]中的研究結(jié)果相似。spr在白色鱗片中表達(dá)較少，可能由于白色鱗片中虹彩細(xì)胞主要合成嘌呤，也可合成一部分蝶啶顆粒（主要是無色的顆粒）的緣故[8]。本研究初步揭示了spr基因在不同體色魚類鱗片中mRNA水平表達(dá)情況，為深入探究spr在魚類體色形成中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。