孫金龍，郭瓊，相珊，趙帥，連方

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250011；2 山東省婦幼保健院；3 山東中醫(yī)藥大學(xué)

年齡是女性卵巢功能的決定性因素[1]，而卵巢功能減退是高齡女性面臨的一個(gè)重要不孕因素。目前，臨床上許多要求生育的高齡女性與晚婚晚育、高齡失獨(dú)等有關(guān)。因此，明確高齡女性卵巢功能衰退的生物學(xué)基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。卵巢功能衰退不是單一、獨(dú)立的事件，與人體衰老一樣，也是多系統(tǒng)、多途徑、多環(huán)節(jié)的整體變化[2，3]，而蛋白質(zhì)組學(xué)研究最能體現(xiàn)這種整體性。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選高齡婦女卵泡液差異表達(dá)蛋白質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行生物信息分析，以探討女性隨年齡增大卵巢功能衰退的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2017年12月～2018年12月于我院擬行輔助生殖技術(shù)助孕的女性患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡21～42歲；②因男方精子數(shù)量和活力不足而導(dǎo)致女性不孕；③簽署相關(guān)的知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①卵巢早衰；②合并子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、卵巢腫瘤、多囊卵巢綜合征、盆腔炎性疾病等；③合并影響卵巢功能的其他系統(tǒng)疾病。共收集女性不孕患者100例，根據(jù)年齡將其分為高齡組(年齡≥35歲)和非高齡組(年齡﹤35歲)各50例。高齡組年齡(37.48±2.08)歲，啟動(dòng)日血清人抗繆勒管激素(AMH)水平(3.37±1.46)ng/mL，雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)(8.70±2.31)個(gè)；非高齡組年齡(29.22±2.84)歲，血清AMH水平(7.55±2.73)ng/mL，雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)(12.68±3.62)個(gè)。高齡組年齡高于非高齡組，而血清AMH、雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)均低于非高齡組(P均<0.05)。

1.2 IVF與卵泡液的獲取 兩組均給予促性腺激素釋放激素(GnRH)拮抗劑方案進(jìn)行促排卵，以基因重組人促卵泡激素150～250 U啟動(dòng)，啟動(dòng)第5天使用GnRH拮抗劑0.25 μg/d直至扳機(jī)日，促卵泡激素用藥時(shí)間11～14 d；在主導(dǎo)卵泡群直徑達(dá)1.8～2.0 cm時(shí)，常規(guī)取卵并收集卵泡液；將卵泡液以3 000 r/min離心l0 min，吸取上清部分置入EP管并編號(hào)，-80 ℃冰箱內(nèi)凍存。

1.3 卵泡液中差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選與鑒定 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。復(fù)蘇卵泡液，4 ℃下以12 000 r/min離心提取蛋白質(zhì)，并以BCA法測(cè)定其濃度。吸取一部分蛋白質(zhì)溶液，用50 mmol/L碳酸氫銨及DTT調(diào)整終濃度為10 mmol/L，再以碘乙酰胺調(diào)整終濃度為50 mmol/L，常溫反應(yīng)30 min，避光。將溶液以超濾管高速離心后，再次用50 mmol/L碳酸氫銨清洗；繼續(xù)使用胰蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)50 mmol/L碳酸氫銨清洗，然后經(jīng)TFA酸化、除鹽等程序后獲得蛋白質(zhì)懸液。使用冷凍干燥儀凍干蛋白質(zhì)懸液，準(zhǔn)備LC-MS/MS檢測(cè)。LC-MS/MS檢測(cè)：液相采用90 min梯度，流速為220 nL/min，預(yù)柱用AcclaimR PepMap100 column，分析柱用AcclaimR PepMap RSLC column。使用Xcalibur2.2 SP1軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以蛋白質(zhì)豐度比>1.67(上調(diào))以及<0.6(下調(diào))為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過(guò)蛋白質(zhì)譜搜庫(kù)軟件Proteome Discoverer搜索UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索后形成原始raw文件。使用Maxquant1.4.0.8軟件對(duì)raw文件在uniprot_proteomes-human.fasta數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)鑒定。

1.4 卵泡液中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 通過(guò)DAVID在線分析軟件(https://david-d.ncifcrf.gov/)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的基因本體論(GO)和京都基因百科全書(shū)(KEGG)富集分析，并導(dǎo)出分析結(jié)果。GO富集分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物進(jìn)程、生物學(xué)功能、細(xì)胞組分，KEEG富集分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相關(guān)信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選結(jié)果 與非高齡組比較，高齡組卵泡液中共篩選獲得23個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中上調(diào)9個(gè)、下調(diào)14個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)名稱(chēng)及其表達(dá)變化

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO富集分析結(jié)果 在生物進(jìn)程方面，差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、補(bǔ)體激活、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控、參與吞噬作用的Fcγ受體信號(hào)通路、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等。在生物學(xué)功能方面，差異表達(dá)蛋白質(zhì)的主要功能包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡(RBP4、TIMP1、IGFBP3、TNFRSF1A、IGFBP6、HGFAC、POLE、GTF3C1、TGFβI、IGFBP7、CCDC112、SYCP2、TRAF6)以及免疫(C1R、IGHG4、Igλ5鏈I區(qū)、FCGR3A、C4A、CST3)、脂代謝(RBP4、APOB、PLTP、AZGP1)、糖代謝(RBP4、AZGP1)、凝血(F13B)等，尤其以細(xì)胞凋亡與增殖調(diào)控方面更為明顯。在細(xì)胞組分方面方面，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要在胞外區(qū)、胞外體、胞外空間、內(nèi)吞囊腔等發(fā)揮作用。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG通路富集分析結(jié)果 KEGG分析顯示，差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于PPAR、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、吞噬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號(hào)通路。

3 討論

高齡女性隨著卵巢儲(chǔ)備功能下降，表現(xiàn)為竇卵泡減少及其分泌的AMH降低。本研究高齡組血清AMH、雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)均低于非高齡組，與之相符。卵細(xì)胞在發(fā)育成熟各個(gè)階段依靠外界反饋調(diào)節(jié)的調(diào)控，而卵泡液正是這些調(diào)控信息的重要媒介。經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析卵泡液的成分，能夠了解卵細(xì)胞的發(fā)育狀況和質(zhì)量。本研究對(duì)卵泡液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)特征與全身整體功能具有高度一致性，即隨著年齡增大，婦女體內(nèi)能量代謝過(guò)程漸趨失調(diào)，尤其表現(xiàn)在糖、脂代謝受損[4]。例如，高齡女性卵泡液中高表達(dá)的IGFBP7能阻礙胰島素發(fā)揮生物效應(yīng)，引起胰島素抵抗；APOB存在于低密度脂蛋白的表面，APOB表達(dá)增多時(shí)表示體內(nèi)低密度脂蛋白水平與高密度脂蛋白比例升高[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)差異表達(dá)的免疫和凝血相關(guān)蛋白質(zhì)，因其功能比較復(fù)雜，與年齡的關(guān)系尚不明確。

差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO及KEGG富集分析顯示，高齡女性卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)顯現(xiàn)出了較為明顯的細(xì)胞凋亡、增殖與分化調(diào)節(jié)方面的變化。本研究鑒定到的TIMP-1可以結(jié)合MMPs并降低其生物活性，從而抑制MMPs的凋亡效應(yīng)[6]。IGF是目前研究發(fā)現(xiàn)最成熟的促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的因子，其高表達(dá)常反映卵細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，而IGFBP-3、IGFBP-6及IGFBP7均可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制IGF活性的發(fā)揮[7，8]。本研究顯示，高齡女性卵泡液中IGFBP-3、IGFBP-6、IGFBP7表達(dá)上調(diào)，提示其存在凋亡效應(yīng)增強(qiáng)。HGFAC是多種細(xì)胞類(lèi)型的促分裂原，TGFβI在細(xì)胞增殖分化過(guò)程中有重要調(diào)控功能。本研究顯示，高齡女性卵泡液中HGFAC、TGFβI表達(dá)下調(diào)，提示其存在增殖、分化效應(yīng)的抑制。

TNF在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用，而TNFRSF1A與Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合可激活FADD引起細(xì)胞凋亡，TRAF6具有細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的雙重作用[9，10]。本研究結(jié)果顯示，高齡女性卵泡液中TRAF6表達(dá)上調(diào)，同樣也顯示出其凋亡效應(yīng)的增強(qiáng)；而TNFRSF1A的表達(dá)下調(diào)理論上應(yīng)為凋亡效應(yīng)抑制，可能與促排卵激素的使用有關(guān)，其原因與意義尚待進(jìn)一步研究。RBP4不僅與胰島素抵抗、糖尿病等有關(guān)，還能阻止卵細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程，使生長(zhǎng)分化因子9和BMP15表達(dá)下調(diào)[11]。本研究中高齡女性卵泡液RBP4表達(dá)上調(diào)，提示凋亡效應(yīng)增強(qiáng)并抑制卵母細(xì)胞成熟。SYCP2是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中不可或缺的一種蛋白質(zhì)[12]，CCDC112下調(diào)可以導(dǎo)致出現(xiàn)細(xì)胞周期的阻滯[13]。本研究中高齡女性卵泡液SYCP2、CCDC112表達(dá)下調(diào)，也顯示出其增殖、分化效應(yīng)抑制，阻礙卵細(xì)胞成熟，這與高齡婦女卵巢功能變化規(guī)律相符。

總之，高齡女性卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)代謝功能總體趨勢(shì)是細(xì)胞凋亡加劇，增殖與分化修復(fù)能力下降，從而導(dǎo)致卵泡凋亡加速、卵細(xì)胞質(zhì)量下降[14，15]，這就使得高齡女性受孕率降低而自然流產(chǎn)率升高。目前臨床上已有大量研究表明，在高齡女性促排卵過(guò)程中，通過(guò)添加生長(zhǎng)激素促進(jìn)卵泡增殖和修復(fù)功能、改善卵細(xì)胞質(zhì)量是有效的[16～18]，這也證實(shí)了本研究的結(jié)果。由于卵泡液的主要來(lái)源是血清，血清蛋白不可避免地對(duì)卵泡液蛋白具有“摻雜”影響，為了將干擾因素控制到最低，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，在后續(xù)研究中除了擴(kuò)大樣本量，我們考慮首先進(jìn)行血清差異表達(dá)蛋白的比較，并在卵泡液差異表達(dá)蛋白比較時(shí)“屏蔽”血清差異表達(dá)蛋白，對(duì)卵泡液中微小差異表達(dá)蛋白進(jìn)行放大，以最大程度保留和呈現(xiàn)女性卵巢蛋白質(zhì)組學(xué)代謝的過(guò)程。