繆華緯，孔凡良，蔣英俊，王鳳云

合肥市第二人民醫(yī)院，合肥230011

急性髓細(xì)胞性白血病(AML)是一種高度惡性的血液性疾病[1,2]。表觀學(xué)調(diào)控尤其是微小RNA(miRNA)對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在白血病發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[3,4]。有研究顯示，基因的異常改變可以導(dǎo)致miRNA功能失活，從而導(dǎo)致白血病干細(xì)胞增殖、分化[6,7]。miR-100被報(bào)道參與AML的發(fā)生發(fā)展[8]，但是其作用機(jī)制尚未明確。近年來的研究表明，白血病的發(fā)生發(fā)展受到微環(huán)境的調(diào)控，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)[9]。2019年1～9月，本研究觀察了MSC中miR-100表達(dá)失調(diào)對(duì)AML細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人骨髓MSC(BFN60808567)購買于青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司。人白血病細(xì)胞株K562來源于安徽醫(yī)科大學(xué)。K562細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、5% CO2)。DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素皆購自美國Gibco公司。miRNA-100的相關(guān)引物購于Invitrogen公司。miRNA提取試劑盒購自TaKaRa公司。miR-100-3p inhibitor質(zhì)粒、慢病毒載體購自上海漢恒公司。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購于康寧公司。PI染色試劑盒購于碧云天公司。Western blotting實(shí)驗(yàn)所用一抗購自美國CST公司，二抗購自美國Sigma公司。

1.2 miR-100低表達(dá)MSC的構(gòu)建 將MSC分為兩組，分別感染miR-100-NC和miR-100-inhibitor慢病毒。感染后觀察熒光強(qiáng)度，并通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。待所有細(xì)胞均有熒光表達(dá)時(shí)即可停止篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。采用qRT-PCR法檢測(cè)MSC中的miR-100，以GAPDH作為內(nèi)參。GAPDH上游引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。miR-100上游引物序列為5′-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG3′，下游引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGAT-ACGACCACAAGT-3′。

1.3 MSC與K562細(xì)胞共培養(yǎng)及分組 兩組MSC培養(yǎng)3 d后，胰酶消化黏附生長的MSC。取1×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待過夜，加入消化好的K562細(xì)胞(懸浮生長)。共培養(yǎng)3 d后，吸取培養(yǎng)基(含有K562細(xì)胞)，離心沉淀獲取K562細(xì)胞，與感染miR-100-NC慢病毒MSC共培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，與感染miR-100-inhibitor慢病毒MSC共培養(yǎng)的細(xì)胞為低表達(dá)組。

1.4 K562細(xì)胞增殖能力觀察 ①M(fèi)TT實(shí)驗(yàn)：于共培養(yǎng)3 d后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將20 μL的MTT溶液分別加至每個(gè)孔并將6孔板置于37 ℃孵箱中孵育2 h。用移液槍吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基及MTT溶液，加入DMSO溶液，在搖床上避光溶解30 min后，上機(jī)檢測(cè)OD值表示細(xì)胞增殖能力。②克隆形成實(shí)驗(yàn)：共培養(yǎng)3 d后采用平板克隆實(shí)驗(yàn)反映細(xì)胞增殖能力。收集細(xì)胞，在6孔板中以5×102/孔接種，加入2 mL完全培養(yǎng)基，放于孵箱中培養(yǎng)14 d。用PBS清洗6孔板，晾干后加入0.1%結(jié)晶紫染色1 h左右，清洗并拍照，觀察克隆形成情況，并計(jì)算克隆形成數(shù)。

1.5 K562細(xì)胞周期蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中的細(xì)胞周期依賴性激酶4(CDK4)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)，以β-actin為內(nèi)參。

1.6 K562細(xì)胞凋亡情況觀察 ①調(diào)亡細(xì)胞：采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組K562細(xì)胞，測(cè)定總細(xì)胞數(shù)。取1×106個(gè)細(xì)胞用含10% FCS、1%疊氮化鈉的冰冷PBS重懸，再向每根離心管中添加100 μL細(xì)胞懸液。按照1∶200加入7AAD和Anexin V染料，室溫孵育30 min，離心洗滌后上機(jī)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。②調(diào)亡相關(guān)蛋白：采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2樣蛋白x(Bax)、cleaved Caspase-3，以β-actin為內(nèi)參。

1.7 低表達(dá)miR-100的MSC中差異表達(dá)生長因子檢測(cè) 收集感染miR-100-NC和miR-100-inhibitor慢病毒的MSC，采用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中已知參與白血病細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的生長因子，結(jié)果顯示低表達(dá)miR-100的MSC中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)基因表達(dá)顯著上調(diào)(分別為0.12±0.02、1.62±0.31，P<0.05)。

1.8 K562細(xì)胞培養(yǎng)液中BMP4檢測(cè) 根據(jù)“1.3”進(jìn)行細(xì)胞分組與處理，采用ELISA法檢測(cè)K562細(xì)胞培養(yǎng)液中的BMP4。

1.9 BMP抑制劑Noggin對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響觀察 將K562細(xì)胞分為對(duì)照組、低表達(dá)組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組細(xì)胞與感染miR-100-NC慢病毒的MSC共培養(yǎng)；低表達(dá)組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與感染miR-100-inhibitor慢病毒的MSC共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)1 d后加入Noggin蛋白。培養(yǎng)2 d后收集K562細(xì)胞，采用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)CDK4、Cyclin D1、Bax、cleaved Caspase-3，以β-actin為內(nèi)參，方法同上。

2 結(jié)果

2.1 低表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較 低表達(dá)組細(xì)胞共培養(yǎng)72 h細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。低表達(dá)組、對(duì)照組共培養(yǎng)3 d克隆形成數(shù)分別為(59±0.05)、(71±0.09)個(gè)，低表達(dá)組高于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 兩組細(xì)胞增殖能力比較

2.2 低表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞周期蛋白表達(dá)比較 低表達(dá)組細(xì)胞中Cyclin D1、CDK4相對(duì)表達(dá)量分別為6.25±0.17、8.21±0.49，對(duì)照組Cyclin D1、CDK4相對(duì)表達(dá)量均為1，低表達(dá)組Cyclin D1、CDK4相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 低表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 低表達(dá)組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為15.9%±1.08%、25.13%±2.31%，低表達(dá)組細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組(P<0.05)。低表達(dá)組Bax、cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.02、0.23±0.01，對(duì)照組分別為1、1，低表達(dá)組Bax、cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.4 低表達(dá)組與對(duì)照組培養(yǎng)液中BMP4水平比較 低表達(dá)組、對(duì)照組培養(yǎng)液中BMP4水平分別為(598±0.28)、(386±0.21)pg/mL，低表達(dá)組培養(yǎng)液中BMP4水平高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5 外源性noggin對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)72 h后細(xì)胞增殖能力低于低表達(dá)組，低表達(dá)組增殖能力高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。實(shí)驗(yàn)組、低表達(dá)組、對(duì)照組克隆形成數(shù)分別為(86±0.26)、(202±0.68)、(102±0.30)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組克隆形成數(shù)少于低表達(dá)組，低表達(dá)組克隆形成數(shù)高于對(duì)照組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組CDK4與Cyclin D1相對(duì)表達(dá)量低于低表達(dá)組，低表達(dá)組CDK4與Cyclin D1表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表3。實(shí)驗(yàn)組、低表達(dá)組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為13.60%±0.65%、0.25%±0.32%、11.20%±0.02%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于低表達(dá)組，低表達(dá)組凋亡率低于對(duì)照組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組Bax、cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于低表達(dá)組，低表達(dá)組Bax、cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表3。

表2 三組細(xì)胞增殖能力比較

表3 三組細(xì)胞中CDK4、Cyclin D1、Bax、cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

miRNA的異常調(diào)節(jié)與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。前期有研究報(bào)道m(xù)iRNA在白血病中呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)，其中miR-100低表達(dá)[11,12]。然而miR-100是如何調(diào)節(jié)AML的進(jìn)程，當(dāng)前知之甚少。

MSC是白血病微環(huán)境中重要的支持細(xì)胞。在獲得特定的基因修飾后，MSC能夠被轉(zhuǎn)化為對(duì)維持造血干細(xì)胞或白血病干細(xì)胞增殖和穩(wěn)態(tài)有利的支持細(xì)胞[13]。Lena等[14]報(bào)道在MSC中敲除IKBα或PARγ小鼠皆能發(fā)生骨髓增殖性腫瘤。MSC作為微環(huán)境中的一員對(duì)骨髓增殖性腫瘤甚至是白血病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。有報(bào)道表明，MSC中的miR-100可通過外泌體的形式參與mTOR/Hif1α信號(hào)調(diào)控，進(jìn)而影響乳腺癌的惡性進(jìn)程[15]。本研究結(jié)果顯示，miR-100敲低的MSC能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期蛋白與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)也相應(yīng)發(fā)生變化。這表明miR-100敲低后，MSC可能通過某種機(jī)制影響白血病細(xì)胞的增殖和凋亡。細(xì)胞周期的調(diào)控主要由細(xì)胞周期調(diào)控蛋白決定[16]。本研究顯示，與miR-100低表達(dá)的MSC共培養(yǎng)后，CDK4在K562細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示通過靶向CDK4可能會(huì)在miR-100低表達(dá)的AML中具有轉(zhuǎn)化治療前景。

MSC對(duì)白血病細(xì)胞的影響至少有兩種，一是分泌細(xì)胞因子直接影響白血病細(xì)胞的功能[17]，二是通過分泌趨化因子募集其他白細(xì)胞(如單核細(xì)胞)對(duì)白血病細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響[9]。本研究采用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M兩種細(xì)胞之間的作用，細(xì)胞因子的篩選成為本研究的重點(diǎn)。我們對(duì)報(bào)道過參與白血病細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示BMP4蛋白上升水平最高。BMP信號(hào)通路調(diào)控干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。但是，BMP信號(hào)通路是否調(diào)控白血病細(xì)胞的增殖，目前仍然知之甚少。本研究結(jié)果顯示，與miR-100敲低的MSC共培養(yǎng)的K562細(xì)胞培養(yǎng)液中BMP4水平升高，提示MSC可能參與BMP4的分泌；而抑制BMP后，K562細(xì)胞增殖受到抑制、凋亡增多，提示miR-100敲低后K562細(xì)胞增殖、凋亡的變化可能與BMP4水平變化有關(guān)。因此，BMP4很有可能參與形成白血病干細(xì)胞的維持、自我更新，并調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的代謝。通過靶向BMP信號(hào)通路可能有助于改善miR-100低表達(dá)白血病患者的預(yù)后。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，miR-100低表達(dá)的MSC可促進(jìn)AML細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，可能是通過上調(diào)BMP4水平實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)將有助于靶向BMP信號(hào)通路的特異性藥物的研發(fā)和應(yīng)用。