李瑞洋，冉智光，羅煉釗，李安菲，曹立亭，馬躍

1 西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460

2 重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460

第21和22種蛋白氨基酸，即硒代半胱氨酸(Sec) 和吡咯賴氨酸 (Pyl)，對于絕大多數(shù)生物細(xì)胞來說仍屬于非天然氨基酸 (Unnatural amino acids，UAAs)[1]。本世紀(jì)初科學(xué)家發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷古菌中Pyl是由琥珀密碼子UAG編碼并在蛋白翻譯過程中插入氨基酸序列中[2-4]。Pyl插入蛋白質(zhì)依靠吡咯賴氨酸氨酰tRNA合成酶 (PylRS) 和吡咯賴氨酸氨酰tRNA (tRNAPyl) 正交對，二者分別由PylS和PylT基因編碼。圖1所示即為產(chǎn)甲烷古菌利用琥珀密碼子在蛋白質(zhì)翻譯過程中將Pyl摻入多肽鏈的過程[5]。該發(fā)現(xiàn)使得人們得以利用基因工程技術(shù)在普通生物細(xì)胞中將一種甚至多種非天然氨基酸定點插入蛋白質(zhì)中，這一基因工程技術(shù)被稱為非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)[6-12]。

非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)利用終止密碼子在蛋白翻譯過程中將非天然氨基酸插入到蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，實際上擴(kuò)展了氨基酸密碼子的數(shù)量，因此非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)也被稱為遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)[4,13]。由于利用密碼子UGA定點插入硒代半胱氨酸 (Sec) 除了需要特定的氨酰tRNA合成酶和tRNA正交對外，還需要mRNA上的順式作用元件SECIS及特殊的延伸因子SelB[1]，而利用UAG密碼子定點插入Pyl則只需要PylS和PylT基因表達(dá)產(chǎn)物即可實現(xiàn)[14]，所以非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)研究大都使用PylRS/tRNAPyl正交對將吡咯賴氨酸或其衍生物插入多肽鏈。但非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)也可以通過對某一常規(guī)蛋白氨基酸的氨酰tRNA合成酶和對應(yīng)的tRNA基因進(jìn)行定向進(jìn)化突變而實現(xiàn)，有研究報道利用人為突變的大腸桿菌TyrRS和tyrosyl tRNACUA正交對，在酵母細(xì)胞中利用UAG密碼子將非天然氨基酸p-acetyl-L-phenylalanine(p-乙?；?L-苯丙氨酸) 插入到蛋白質(zhì)中[15]。

圖1 Pyl在蛋白翻譯過程中定點插入多肽鏈的機制Fig.1 Mechanism of Pyl insertion into polypeptide chain during protein translation.

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是由20種天然蛋白氨基酸構(gòu)成的，因此我們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究當(dāng)然會受到這20種氨基酸的限制。而利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在原核生物或真核生物蛋白質(zhì)中定點引入非天然氨基酸無疑為蛋白質(zhì)的生物化學(xué)研究和蛋白質(zhì)操縱提供了全新的技術(shù)手段。非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)最直接的應(yīng)用就是利用具有特定生物正交反應(yīng)性質(zhì)的非天然氨基酸在活細(xì)胞中對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，這對目標(biāo)蛋白功能研究具有巨大的工具意義[16]。如有研究者將合成含有脂肪族疊氮化合物和/或烷基化合物的吡咯賴氨酸類似物定點插入蛋白質(zhì)后通過“點擊”化學(xué)修飾高效地進(jìn)行蛋白標(biāo)記[17]。將顯色基團(tuán)與插入目標(biāo)蛋白的UAAs耦合后可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)的光譜分析[18]。熒光基團(tuán)與蛋白質(zhì)上的UAAs偶聯(lián)使探針與目標(biāo)之間的距離最小化，為超分辨率顯微鏡的觀察提供便利[19]。也有研究將光親和性非天然氨基酸插入目標(biāo)蛋白作為質(zhì)譜識別標(biāo)簽，顯著提高了對蛋白質(zhì)相互作用的識別靈敏度[20]。賴氨酸乙?；且环N蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，它和蛋白質(zhì)磷酸化一樣對真核細(xì)胞具有重要的調(diào)控意義。有研究利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)通過大腸桿菌制備了插入Ne-乙酰基賴氨酰酸的重組蛋白，為蛋白質(zhì)乙?；募?xì)胞功能研究提供了新的手段[21]。

除了在蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究中具有多種應(yīng)用外，非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在應(yīng)用性研究中也展露出巨大的潛力。有研究利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)引入UAAs以開發(fā)新型蛋白藥物 (如抗體和激素)，或?qū)⒉迦肓朔翘烊话被岬目贵w通過非天然氨基酸與細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)物以靶向癌細(xì)胞[22-23]。此外，通過非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在酶中引入UAAs提高酶活或控制酶活在工業(yè)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域均具有應(yīng)用開發(fā)潛力[24]。下文將簡要綜述非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在新型基因工程活病毒疫苗研究中的應(yīng)用和前景。

1 傳統(tǒng)疫苗和現(xiàn)有基因工程疫苗的優(yōu)缺點

疫苗的發(fā)展是1796年英國醫(yī)生Edward Jenner通過實驗證明了牛痘能夠預(yù)防天花開始的[25]，此后疫苗成為了預(yù)防 (甚至治療) 很多感染性疾病，特別是病毒病最有力的手段。到目前為止，學(xué)界根據(jù)疫苗所含免疫原成分不同將疫苗劃分3代：全病原體制備的疫苗為第一代疫苗，包括滅活苗和弱毒 (活) 疫苗；利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)抗原制備的疫苗為第二代疫苗；核酸(主要為DNA) 制備的疫苗為第三代疫苗[26]。第一代疫苗為具有悠久應(yīng)用歷史的傳統(tǒng)疫苗，而第二代疫苗是20世紀(jì)80年代后才出現(xiàn)的新型基因工程亞單位疫苗，迄今已有一些此類疫苗應(yīng)用于臨床。第二代疫苗盡管安全性高、易于低成本大規(guī)模制備，但其免疫效果其實不如第一代疫苗，其主要原因是第二代疫苗只含有目標(biāo)病原體的部分抗原，因此與第一代全病原體疫苗相比總是存在免疫原性的損失。第三代疫苗 (核酸疫苗) 因免疫效果不理想，目前基本還處于研究階段或臨床前研究階段。

在至今仍為主流的第一代疫苗中，滅活疫苗是通過物理因素或者化學(xué)方法處理病毒后使病原喪失感染性和復(fù)制能力而變得無毒，其安全性得到有效的保證。但是滅活疫苗在滅活過程中會造成抗原變性因而帶來免疫原性損失，且通過抗原遞呈細(xì)胞 (Antigen presenting cell，APC) 內(nèi)源性加工處理實現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (Cytotoxic T lymphocyte，CTL) 的活化、增殖的效率較低，因此盡管體液免疫效果尚可而細(xì)胞免疫效果較差，常需要刺激性較大的免疫佐劑和多次免疫才能達(dá)到較好的免疫效果。

減毒活疫苗是經(jīng)過長期體外培養(yǎng)及減毒處理制備的活病原體疫苗，與野毒株相比其免疫原性幾乎沒有發(fā)生改變，作為疫苗進(jìn)入動物體內(nèi)后其能主動感染宿主的APC細(xì)胞從而高效呈遞抗原，因此細(xì)胞免疫和體液免疫效果均良好。但是，減毒活疫苗可以在動物體內(nèi)復(fù)制傳代 (只是復(fù)制能力沒有野毒株強)，從而發(fā)生變異和進(jìn)化，存在毒力返強的風(fēng)險[27-29]，因此安全性較低是傳統(tǒng)減毒活疫苗最大的短板。那么有沒有可能研發(fā)出兼具減毒活疫苗高效性與滅活疫苗高安全性的疫苗呢？基因工程技術(shù)的持續(xù)發(fā)展不斷地為疫苗研發(fā)提供新的技術(shù)手段，上述非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在新型活病毒疫苗研究方面則展示出了巨大的潛力。

2 利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復(fù)制缺陷型病毒的原理

病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，其基因組較小且各基因功能清楚。因此，通過反向遺傳學(xué)技術(shù)在病毒復(fù)制必需的關(guān)鍵基因 (病毒基因組復(fù)制酶基因或病毒粒子包裝蛋白基因) 中引入提前終止密碼子 (Premature stop codon，PTC)，利用人為構(gòu)建并含有非天然氨基酸正交翻譯機制的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，通過添加對應(yīng)的UAA即可制備PTC突變病毒。Liu等[30]從合成生物學(xué)的角度將這一技術(shù)原理稱為“條件性敲除” (Conditional knockout)。其實，其技術(shù)本質(zhì)也可以理解為對目標(biāo)病毒的遺傳性滅活 (Genetic inactivation)。

由于PTC突變病毒只是用UAA替換了極少的氨基酸 (一至數(shù)個)，即使PTC突變位于病毒的主要抗原基因中 (如病毒的Cap蛋白)，對其免疫原性影響也是微乎其微的，因此PTC突變病毒幾乎具有與野生型病毒相同的感染性和免疫原性，從激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的角度來說是一種優(yōu)良的活病毒疫苗，完全可以與傳統(tǒng)的減毒活疫苗相比。另一方面，由于正常宿主細(xì)胞 (包括動物活體細(xì)胞) 不具備非天然氨基酸正交翻譯機制，也不含有非天然氨基酸，所以PTC突變病毒感染正常宿主細(xì)胞后不能產(chǎn)生子代病毒，因此是一種復(fù)制缺陷型病毒。在正常宿主細(xì)胞不能復(fù)制傳代則意味著PTC突變病毒作為疫苗應(yīng)用時在動物體內(nèi)發(fā)生變異和進(jìn)化的概率極低，也就是說發(fā)生毒力返強的概率極低。因此，相對于安全性較低的傳統(tǒng)減毒活疫苗來說，通過非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備的PTC突變病毒可以稱為安全的活病毒疫苗。

3 非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)用于新型活病毒疫苗研究進(jìn)展

2013年Lin等利用PylRS/tRNAPyl正交對在哺乳動物細(xì)胞中將5種非天然氨基酸 (均為Pyl類似物) 定點插入HBV的L蛋白中，制備出含有UAA的活HDV病毒顆粒，并證實了可以通過點擊化學(xué)方法并引入UAA對這些HDV病毒進(jìn)行有效標(biāo)記[31]。盡管該研究并非旨在疫苗研究，但其首次從技術(shù)上證實了非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)可以用于制備復(fù)制缺陷型PTC病毒。

2014年Jiantao Guo團(tuán)隊首次以新型活病毒疫苗研究為目的，利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備了在正常宿主細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制傳代的HIV-1病毒 (圖2)[32]。該研究利用源自大腸桿菌的AzFRS/tRNATyr正交對和琥珀密碼子TAG，將非天然氨基酸4-azidophenylalanine (AzF，絡(luò)氨酸類似物) 引入HIV-1 GAG基因、POL基因和HIV蛋白酶基因的不同位置制備了PTC病毒，并比較各種PTC病毒在含有AzFRS/tRNATyr正交對的轉(zhuǎn)基因293T細(xì)胞中的滴度以及收獲的子代病毒對不含AzFRS/tRNATyr正交對的TZM-bl細(xì)胞的感染性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HIV蛋白酶基因的Tyr59位置引入TAG的PTC的病毒能夠在含AzFRS/tRNATyr正交對的轉(zhuǎn)基因293T細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生感染性PTC病毒顆粒。盡管該研究未進(jìn)一步驗證制備的PTC突變HIV-1病毒作為活疫苗的免疫效力和安全性，但是首次揭示和證實了利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復(fù)制缺陷型活病毒疫苗的研究策略及其可行性。后來該團(tuán)隊在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步將引入非天然氨基酸的琥珀密碼子TAG擴(kuò)展為四聯(lián)碼TAGA并制備出復(fù)制缺陷型HIV-1病毒[33]。這一改進(jìn)的優(yōu)點很明顯，因為用四聯(lián)碼TAGA作為PTC與三聯(lián)碼TAG相比在病毒傳代過程中發(fā)生回復(fù)突變 (即PTC突變回有義密碼子) 的概率低得多。該團(tuán)隊在另一項研究中直接將AzFRS/tRNATyr正交對插入HIV-1病毒基因組中構(gòu)建自帶非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)的PTC病毒[34]，這一技術(shù)路線有兩大優(yōu)勢，一是不再需要專門構(gòu)建用以制備PTC病毒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；二是可以利用非天然氨基酸對感染細(xì)胞的PTC病毒的復(fù)制水平進(jìn)行調(diào)控，斷絕非天然氨基酸的供應(yīng)即可“關(guān)閉”PTC病毒的復(fù)制。但該研究只是在培養(yǎng)的細(xì)胞中證實了可以通過非天然氨基酸對感染細(xì)胞內(nèi)的PTC病毒的復(fù)制水平進(jìn)行調(diào)控，尚未驗證這一精致的病毒復(fù)制調(diào)控機制能否在活體動物上實現(xiàn)。

圖2 利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復(fù)制缺陷型HIV-1病毒的原理Fig.2 Mechanism of replication-deficient HIV-1 virus preparation via orthogonal translation of unnatural amino acids.

圖3 利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復(fù)制缺陷型流感病毒的原理Fig.3 Mechanism of replication-deficient influenza virus preparation via orthogonal translation of unnatural amino acids.

北京大學(xué)周德敏課題組在一項研究中構(gòu)建了幾十個在不同基因的不同位置含有提前終止密碼子的PTC流感病毒的感染性克隆，然后利用含有MbpylRS/tRNACUA正交對的轉(zhuǎn)基因293T細(xì)胞并通過添加非天然氨基酸Ne-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine (NAEK) 制備了復(fù)制缺陷型流感病毒(圖3)[35]。研究結(jié)果顯示構(gòu)建的絕大部分PTC流感病毒都只能在添加NAEK的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中復(fù)制，在非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或不添加NAEK的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中均不能復(fù)制，證實了制備的復(fù)制缺陷型流感病毒對正常細(xì)胞的安全性。該研究進(jìn)一步對一株含有4個提前終止密碼子 (PA-R266、PB2-K33、PB1-R52、NP-D101) 的復(fù)制缺陷型流感病毒PTC-4A作為候選疫苗株進(jìn)行了深入的研究，同株野生型病毒對小鼠的LD50為8×103PFU，而小鼠攻毒試驗證實用109PFU的PTC-4A進(jìn)行攻毒后10只小鼠無一發(fā)病或死亡。在105PFU攻毒劑量下，PTC-4A株與CIAV株 (商品化的冷適應(yīng)弱毒疫苗株) 相比無論是體重情況和第3天組織帶毒量均明顯優(yōu)于CIAV株，證實了PTC-4A株的安全性優(yōu)于常規(guī)的弱毒疫苗株。在免疫效力方面，小鼠免疫實驗證實PTC-4A株與CIAV株相比在HI抗體滴度、NT抗體滴度、IgA抗體滴度和特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)各方面均無顯著差異，但顯著優(yōu)于滅活疫苗。小鼠免疫保護(hù)實驗證實在兩次免疫和50倍LD50攻毒情況下，PTC-4A株與CIAV株免疫小鼠存活率均為100%，而滅活疫苗免疫小鼠的存活率只有70%。

該研究以流感病毒為目標(biāo)，完整展現(xiàn)了利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)研發(fā)復(fù)制缺陷活病毒疫苗的策略，而且對這種缺陷型流感病毒作為候選疫苗的安全性方面進(jìn)行了全面的驗證，并用免疫保護(hù)實驗證實了這種缺陷型流感病毒作為候選疫苗的效果優(yōu)于已經(jīng)商品化的傳統(tǒng)減毒活疫苗。該研究論文于2016年底在Science上發(fā)表，至此非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)被視為革命性的新型基因工程活病毒疫苗研發(fā)技術(shù)。

4 展望

利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備的復(fù)制缺陷病毒作為疫苗在理論上具有與傳統(tǒng)減毒活疫苗相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?，而且其不能在動物體內(nèi)復(fù)制傳代，因此不能在動物體內(nèi)發(fā)生變異和進(jìn)化，所以其安全性遠(yuǎn)高于能在動物體內(nèi)傳代的傳統(tǒng)減毒活疫苗。根據(jù)所選PTC突變基因的不同，可以將利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備的復(fù)制缺陷病毒分為兩類：基因組復(fù)制缺陷型PTC病毒和包裝缺陷型PTC病毒，二者的安全性會有所不同?；蚪M復(fù)制缺陷型PTC病毒構(gòu)建時選擇病毒基因組復(fù)制必需基因 (如核酸復(fù)制酶基因) 引入PTC突變，因此制備的PTC病毒作為疫苗感染動物細(xì)胞后其基因組不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，所以發(fā)生終止密碼子回復(fù)突變 (遺傳逃逸) 的可能性為零。而包裝缺陷型PTC病毒構(gòu)建時選擇病毒包裝必需的基因 (通常是病毒的衣殼蛋白) 引入PTC突變，制備的PTC病毒作為疫苗感染動物細(xì)胞后其基因組能完成復(fù)制 (但是不能包裝形成子代病毒顆粒)，而在其基因組復(fù)制過程中就可能發(fā)生回復(fù)突變，因此其安全性應(yīng)低于基因組復(fù)制缺陷型PTC病毒，但其安全性還是遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)減毒活疫苗。當(dāng)然，如果構(gòu)建在病毒基因組復(fù)制必需基因和病毒包裝必需基因中均含有PTC突變的復(fù)制缺陷病毒，則其發(fā)生遺傳逃逸的幾率將更低。周德敏課題組的研究證實只含一個提前終止突變的病毒傳20代后遺傳逃逸率最高約為10–8，而含2個或更多PTC突變的病毒傳20代后遺傳逃逸率最高約為10–11[35]。這些遺傳逃逸率是在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中和添加UAA情況下傳代后測定的，而在免疫實驗中從免疫后3 d小鼠的呼吸道組織中未檢測到有任何回復(fù)突變的病毒，充分證實了利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備的復(fù)制缺陷病毒作為疫苗的安全性。

此外，利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備的復(fù)制缺陷病毒還具有極高的生物安全性，因為其作為疫苗應(yīng)用時釋放到生物環(huán)境中的基因是含有PTC突變的基因，含有PTC突變的基因是無毒的基因 (因為含PTC突變的基因在正常宿主細(xì)胞無法表達(dá))，它如果與生物環(huán)境中的同源基因發(fā)生重組也只能形成還有PTC突變的無毒基因。相反，通過改變氨基酸序列構(gòu)建的基因工程弱毒疫苗，其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐時釋放到生物環(huán)境中的基因同生物環(huán)境中的同源基因發(fā)生重組則可能產(chǎn)生毒力恢復(fù)或毒力更強的毒株。

利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備的復(fù)制缺陷病毒除了可用作預(yù)防性疫苗之外還具有作為治療性疫苗的潛力。其機理是帶有提前終止突變的PTC病毒可能與野生型病毒發(fā)生基因重組或重排 (分節(jié)段基因組病毒) 從而降低已感染野生型病毒的復(fù)制效率，周德敏課題組的研究證實PTC流感病毒與野生型病毒共感染正常宿主細(xì)胞時能明顯降低野生型病毒的復(fù)制效率[35]。

理論上說，任何一種病毒只要能構(gòu)建其反向遺傳系統(tǒng)就可以應(yīng)用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)研究和開發(fā)該病毒的復(fù)制缺陷型活病毒疫苗。但是該技術(shù)用于復(fù)制缺陷型活病毒疫苗研究也存在兩大難點：一是由于其涉及的基因工程技術(shù)機制過于精致、復(fù)雜，技術(shù)門檻較高；二是由于引入的PTC突變在非天然氨基酸正交翻譯過程中將與細(xì)胞內(nèi)的延伸因子eRF1發(fā)生競爭[36]，導(dǎo)致插入非天然氨基酸的效率不高，降低突變病毒在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的復(fù)制效率 (即復(fù)制缺陷活病毒疫苗的生產(chǎn)效率)。盡管如此，非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)依然是一種創(chuàng)新的、潛力巨大的新型基因工程活病毒疫苗技術(shù)，可以預(yù)見會有更多利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)研究復(fù)制缺陷型活病毒疫苗見諸報道。如能解決上述復(fù)制缺陷活病毒疫苗生產(chǎn)效率的限制性難題，則基于非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)的復(fù)制缺陷型活病毒疫苗就可以走向?qū)嵱没?/p>