吳思佳，李杰，胡晨龍，田俊宇，張通，陳寧，范曉光

天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457

5′-胞苷酸 (簡(jiǎn)稱胞苷酸) 是一種重要的核苷酸產(chǎn)品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應(yīng)用于不同領(lǐng)域[1]。胞苷酸是制備核苷酸衍生物的重要中間體，可作為原材料生產(chǎn)胞苷三磷酸、阿糖胞苷酸、胞二磷膽堿和聚肌胞苷酸等[2]。胞苷酸在成年人、嬰幼兒和哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[3-5]，含有胞苷酸的嬰幼兒奶粉功效更接近于母乳，能顯著提高嬰幼兒免疫力[6-7]。

工業(yè)上常用核酸水解法生產(chǎn)胞苷酸，通常是提取酵母細(xì)胞中的核糖核酸，經(jīng)核酸酶水解得到4種核苷單磷酸 (腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸和尿苷酸) 混合物后，再經(jīng)過(guò)離子交換法分離精制得到胞苷酸[8-9]。核酸水解法具有原料來(lái)源廣泛和反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，但是生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、分離精制工序復(fù)雜且加工成本較高?；瘜W(xué)法生產(chǎn)胞苷酸[10-11]，通常是用磷酸或者焦磷酸的活性衍生物與核苷進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)步驟繁瑣、所用試劑昂貴且含有毒試劑，因此只適用于小規(guī)模生產(chǎn)且產(chǎn)品無(wú)法在食品領(lǐng)域中應(yīng)用。

尿苷-胞苷激酶 (Uridine-cytidine kinase, UCK)是一種嘧啶核糖核苷激酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)物體和人體內(nèi)，是核苷酸代謝補(bǔ)償途徑中一種重要的催化劑[12-15]。UCK可以催化尿苷和胞苷磷酸化成為尿苷酸和胞苷酸[16]，但需要NTP作為磷酸供體。已有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、保加利亞乳桿菌、枯草芽孢桿菌來(lái)源的UCK均需要以GTP作為磷酸供體，但由于GTP原料成本過(guò)高，難以工業(yè)化放大[17-18]。

嗜熱棲熱菌Thermus thermophilusHB8來(lái)源的尿苷-胞苷激酶具有對(duì)胞苷的高度專一性，其Km值為72 μmol/L，只能夠催化胞苷到胞苷酸的反應(yīng)[19]。我們對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域中含有3個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)、6個(gè)嘧啶堿基特異性位點(diǎn)和3個(gè)核糖特異性位點(diǎn)，因此推測(cè)其能夠以ATP作為磷酸供體完成催化反應(yīng)。為了降低反應(yīng)中ATP的消耗量，我們使用類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides來(lái)源的聚磷酸激酶(Polyphosphate kinase, PPK) 以ADP和六偏磷酸鈉為底物催化生成ATP[20]，從而實(shí)現(xiàn)ATP的循環(huán)再生。為了增加酶的利用率，我們根據(jù)親和層析的原理，使用D403金屬螯合樹(shù)脂吸附Ni2+形成固定化載體，由于Ni2+能與重組蛋白攜帶的組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行配位結(jié)合[21]，因此固定化載體能夠選擇性地吸附重組蛋白，從而在純化重組蛋白的同時(shí)將其固定于樹(shù)脂表面。使用上述固定化酶用于胞苷酸的制備，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，為大規(guī)模生產(chǎn)胞苷酸提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliDH5α、BL21(DE3)以及質(zhì)粒pET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0–7.2，121 ℃滅菌20 min。

TB (Terrific肉湯) 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，甘油4 mL/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，pH 7.0–7.2，KH2PO4和K2HPO4與其他成分分開(kāi)滅菌，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因有限責(zé)任公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胞苷標(biāo)品、CMP標(biāo)品、ATP購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 UCK蛋白的生物信息學(xué)分析

使用ExPASy服務(wù)器 (http://web.expasy.org/protparam/) 的ProtParam分析UCK蛋白的理化性質(zhì)。使用NCBI CD search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/) 分析UCK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。使用在線程序ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)、TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP4.1服務(wù)器 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析UCK蛋白的親疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽等功能區(qū)。

1.3 重組菌株的構(gòu)建及重組酶的制備

1.3.1 質(zhì)粒pET-28a-uck的構(gòu)建

根據(jù)UCK蛋白的編碼基因序列 (GenBank登錄號(hào)3168643)，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以大腸桿菌常見(jiàn)密碼子替換其稀有密碼子，使其可在大腸桿菌中高效表達(dá)，將優(yōu)化后的序列送至金唯智公司進(jìn)行合成，獲得攜帶UCK編碼基因的重組質(zhì)粒pUC57-uck。使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pET-28a質(zhì)粒載體以及pUC57-uck。獲得線性化的pET-28a載體和uck基因片段，在T4 DNA連接酶的作用下連接載體與片段，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，再使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得pET-28a-uck質(zhì)粒。

1.3.2 質(zhì)粒pET-28a-ppk的構(gòu)建

以Rhodobacter sphaeroides基因組為模板，根據(jù)PPK蛋白的編碼基因序列 (GenBank登錄號(hào)3720266，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ的上下游引物。使用引物及Ex-TaqPCR試劑盒擴(kuò)增得到聚磷酸激酶編碼基因ppk。使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對(duì)pET-28a質(zhì)粒載體以及ppk基因片段進(jìn)行消化，在T4 DNA連接酶的作用下連接載體與片段，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，再使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得pET-28a-ppk質(zhì)粒。引物序列如表1所示。

1.3.3 重組菌株的構(gòu)建

取適宜濃度的質(zhì)粒pET-28a-uck和pET-28appk分別化轉(zhuǎn)至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，在SOC培養(yǎng)基中活化后涂布于含硫酸卡那霉素(50 μg/mL) 的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落經(jīng)菌落PCR篩選出符合要求的陽(yáng)性克隆菌株，將陽(yáng)性菌株接入含有硫酸卡那霉素(50 μg /mL) 的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，保存至甘油管保菌管中，于-80 ℃冰箱保藏。

1.3.4 重組酶的制備

將重組菌株從甘油保菌管中以1% (V/V) 的接種量接種至5 mL含有硫酸卡那霉素 (50 μg /mL)的LB液體培養(yǎng)基搖管中，于37 ℃、200 r/min活化培養(yǎng)12 h；以1% (V/V) 接種量轉(zhuǎn)接至30 mL含有硫酸卡那霉素 (50 μg /mL)的LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，再按2% (V/V) 接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含有硫酸卡那霉素 (50 μg /mL) 的TB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)至OD600達(dá)到1.8–2.4時(shí)添加終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，25 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體。使用PBS緩沖液 (pH 7.4) 或生理鹽水重懸清洗菌體細(xì)胞2–3次，再用30 mL裂解緩沖液 (50 mmol/L Na2HPO4、300 mmol/L NaCl，用NaOH調(diào)pH至8.0) 重懸均勻后，使用高壓勻漿細(xì)胞破碎儀 (上海永聯(lián)生物) 破碎細(xì)胞，6 ℃、80 MPa破碎5 min，細(xì)胞破碎液經(jīng)13 000 r/min離心20 min后取上清液，即為含有重組酶的粗酶液。

表1 ppk基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers for ppk gene amplification

1.4 固定化載體的制備

1.4.1 樹(shù)脂活化

取適量D403金屬螯合樹(shù)脂 (江蘇蘇青)，用去離子水沖洗后浸泡20 min，重復(fù)5次，清洗干凈后填入親和層析柱。用4% HCl溶液過(guò)柱活化樹(shù)脂直至流出液pH至1–2，靜置浸泡6 h，再用去離子水洗至中性。用4% NaOH溶液過(guò)柱活化樹(shù)脂直至流出液pH至13–14，靜置浸泡6 h，再用去離子水洗至中性待用。

1.4.2 固定化載體的制備

將100 mmol/L的硫酸鎳溶液泵入到層析柱中，流速為1 mL/min，使鎳離子吸附在樹(shù)脂上。流出液可以循環(huán)泵入到層析柱中，吸附2 h后用去離子水清洗樹(shù)脂，即制成鎳離子型金屬螯合樹(shù)脂，即固定化載體。

1.4.3 制備固定化酶

取制備好的固定化載體填于2根層析柱中，每根填量20 g，用裂解緩沖液平衡固定化載體。將提前準(zhǔn)備好的UCK粗酶液和PPK粗酶液分別泵入到2根層析柱中，流速為1 mL/min。重組蛋白攜帶的組氨酸標(biāo)簽與鎳離子進(jìn)行配位結(jié)合從而特異性吸附在固定化載體上。將流出液循環(huán)泵入到層析柱中，循環(huán)吸附3次，即制得固定化酶。

1.5 固定化酶催化反應(yīng)體系

使用50 mmol/L、Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)為溶劑，準(zhǔn)確稱取不同濃度的胞苷和六偏磷酸鈉，40 mmol/L MgSO4·7H2O和0.5 mmol/L ATP充分溶解，加入1% (V/V) 的溴麝香草酚藍(lán)指示劑，用NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH值后用容量瓶定容至200 mL。

取20 mL配制好的反應(yīng)液于100 mL三角瓶中，加入固定化UCK的濕樹(shù)脂6 g、固定化PPK的濕樹(shù)脂4 g，在200 r/min的恒溫水浴搖床中反應(yīng)6 h，反應(yīng)過(guò)程中根據(jù)反應(yīng)液顏色變化調(diào)節(jié)pH值保持恒定。

酶活力單位定義：在標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定條件下，1 min催化底物胞苷生成1 μmol /L胞苷酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，即1 U。

1.6 分析檢測(cè)方法

使用高效液相色譜 (HPLC) 檢測(cè)反應(yīng)液中的胞苷和胞苷酸。色譜柱為SepaxHP-C18 (4.6 mm×250 mm，直徑5 μm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流動(dòng)相為0.6%磷酸 (用三乙胺調(diào)pH 6.6)，柱溫30 ℃，流速1 mL/min。如圖1所示，胞苷的保留時(shí)間為20.9 min，胞苷酸的保留時(shí)間為17.4 min。按公式1計(jì)算胞苷酸的摩爾得率，按公式2計(jì)算固定化載體對(duì)蛋白的負(fù)載量。

圖1 胞苷和胞苷酸標(biāo)品液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of cytidine and CMP standards.

2 結(jié)果與分析

2.1 UCK蛋白的生物信息學(xué)分析

使用ExPASy Protemics Server提供的在線工具ProtParam對(duì)UCK蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。推測(cè)分子式為C1066H1720N302O292S7，相對(duì)分子質(zhì)量26.6 kDa，理論等電點(diǎn) (pI) 為9.30，負(fù)電荷氨基酸殘基 (Asp和Glu) 總數(shù)為26，正電荷氨基酸殘基(Arg和Lys) 總數(shù)為30。不穩(wěn)定指數(shù)為47.73 (＞40)，表明UCK蛋白為不穩(wěn)定蛋白，親水性總平均指數(shù)為-0.086 (＜0)，表明UCK蛋白為親水性蛋白。

利用NCBI CD search分析UCK蛋白質(zhì)序列保守結(jié)構(gòu)域。UCK蛋白屬于NK超家族，PRK05480家族，無(wú)多重結(jié)構(gòu)域，含有3個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，6個(gè)嘧啶堿基特異性位點(diǎn)和3個(gè)核糖特異性位點(diǎn)。SignalP 4.1 server預(yù)測(cè)UCK蛋白不含信號(hào)肽，為非分泌型蛋白。TMHMM server預(yù)測(cè)該蛋白不含跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白。ProtScale預(yù)測(cè)UCK蛋白的親疏水性，結(jié)果表明肽鏈中的第112位氨基酸疏水性最強(qiáng)，第95位氨基酸親水性最強(qiáng)，整條肽鏈中疏水性氨基酸總數(shù)少于親水性氨基酸總數(shù)，進(jìn)一步證明該蛋白為可溶性親水蛋白。

2.2 UCK蛋白的重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)初探

為了獲得更多的UCK蛋白，我們使用大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)，以pET-28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體。根據(jù)GenBank中的UCK蛋白編碼基因序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化和人工合成后連接到pET-28a質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-uck。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，如圖2A所示。以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ單酶切重組質(zhì)粒，在6 000 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的條帶。以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒，分別在5 300 bp和700 bp附近出現(xiàn)與空質(zhì)粒和目的基因大小一致的條帶，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 UCK蛋白的重組表達(dá)驗(yàn)證Fig.2 Recombinant expression validation of protein UCK.(A) Restriction map of the recombinant plasmid.M: DNA marker; 1: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a; 2: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a; 3:target gene fragment; 4: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a-uck; 5: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a-uck.(B) SDS-PAGE analysis of recombinant proteins.M: protein marker; 1: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 2: precipitation samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 3: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a-uck; 4: precipitation in the cell lysates of E.coli pET-28a-uck.

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，接種于含有硫酸卡那霉素的TB培養(yǎng)基中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。收集菌體細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿破碎，對(duì)破碎后的上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2B所示。上清液在27 kDa附近出現(xiàn)明顯的條帶，與UCK蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明該蛋白能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)。

為了驗(yàn)證UCK的催化效果，配制催化反應(yīng)體系，加入總蛋白濃度1.9 mg/mL的UCK粗酶液、30 mmol/L胞苷、30 mmol/L六偏磷酸鈉以及30 mmol/L ATP，在pH 8.0、30 ℃的條件下反應(yīng)6 h，使用HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有胞苷酸的特征峰，說(shuō)明UCK能夠以ATP作為磷酸供體催化胞苷到胞苷酸的反應(yīng)。

2.3 PPK蛋白的重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)初探

用于ATP再生的酶主要為激酶，通常這類酶的作用是將ATP或其他核苷酸上的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體分子。該過(guò)程的逆反應(yīng)常被用于將ADP復(fù)磷酸化為ATP。激酶是否適用于ATP再生系統(tǒng)的主要影響因素在于成本和穩(wěn)定性。近年來(lái)應(yīng)用和研究最多的磷酸轉(zhuǎn)移酶是PPK，該酶能夠催化γ-磷酸鹽從ATP轉(zhuǎn)移到無(wú)機(jī)多聚磷酸(PolyP) 的可逆反應(yīng)。由于PolyP低廉的價(jià)格，不同微生物來(lái)源的PPK在ATP再生反應(yīng)中有著巨大的潛力[22-23]。

根據(jù)GenBank上的PPK蛋白編碼基因序列，經(jīng)基因組擴(kuò)增后連接到pET-28a質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-ppk。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，如圖3A所示。以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ單酶切重組質(zhì)粒，在6 300 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的條帶。以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒，分別在5 300 bp和1 000 bp附近出現(xiàn)與空質(zhì)粒和目的基因大小一致的條帶，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，接種于含有硫酸卡那霉素的TB培養(yǎng)基中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。收集菌體細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿破碎，對(duì)破碎后的上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3A所示。上清液在44 kDa附近出現(xiàn)明顯的條帶，與PPK蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明該蛋白能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)。

圖3 PPK蛋白的重組表達(dá)驗(yàn)證Fig.3 Recombinant expression validation of protein PPK.(A) Restriction map of the recombinant plasmid.M: DNA marker; 1: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a; 2: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a; 3:target gene fragment; 4: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a-ppk; 5: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a-ppk.(B) SDS-PAGE analysis of recombinant proteins.M: protein marker; 1: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 2: precipitation samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 3: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a-ppk; 4: precipitation in the cell lysates of E.coli pET-28a-ppk.

為了驗(yàn)證雙酶偶聯(lián)的催化效果，配置催化反應(yīng)體系，加入總蛋白濃度1.9 mg/mL UCK粗酶液和總蛋白濃度1.3 mg/mL PPK粗酶液，30 mmol/L胞苷、30 mmol/L六偏磷酸鈉以及0.5 mmol/L ATP，在pH 8.0、30 ℃的條件下反應(yīng)6 h，使用HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有胞苷酸的特征峰，說(shuō)明Rhodobacter sphaeroides來(lái)源的PPK能夠有效催化ATP的再生反應(yīng)，顯著降低ATP的使用量。

2.4 固定化酶的制備及催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 固定化酶的制備原理

使用pET-28a質(zhì)粒表達(dá)蛋白時(shí)，會(huì)在蛋白表面攜帶6個(gè)組氨酸分子組成的標(biāo)簽。由于組氨酸含有的咪唑基團(tuán)可以提供電子與金屬離子進(jìn)行配位結(jié)合，因此含有這些氨基酸殘基的蛋白會(huì)特異性吸附在含有金屬離子的固定化載體上。D403金屬螯合樹(shù)脂是在大孔隙交聯(lián)結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯共聚球體上引入亞胺基二乙酸螯合基團(tuán)形成的離子交換樹(shù)脂，可以選擇性地交換吸附二價(jià)金屬離子。如圖4所示，使用D403樹(shù)脂吸附Ni2+形成固定化載體，再用于重組蛋白的特異性吸附，即可實(shí)現(xiàn)從粗酶液中原位純化固定化重組蛋白。將固定化酶用于胞苷酸的催化合成反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 固定化酶催化反應(yīng)示意圖Fig.4 Schematic diagram of catalytic reaction of immobilized enzymes.

根據(jù)公式2計(jì)算固定化載體對(duì)蛋白的負(fù)載量，經(jīng)計(jì)算得固定化載體對(duì)UCK的負(fù)載量為330 μg/g，固定化載體對(duì)PPK的負(fù)載量為210 μg/g。固定化前后UCK的酶活損失為3%，PPK的酶活損失為5%。

2.4.2 pH值對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響

按照1.5的方法配制催化反應(yīng)體系，考察底物胞苷和六偏磷酸鈉的加入量分別為30 mmol/L和15 mmol/L，用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)過(guò)程中的pH值，考察pH值對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響。如圖5所示，當(dāng)pH值在 6.0–10.0范圍內(nèi)變化時(shí)，產(chǎn)物胞苷酸濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，胞苷酸濃度達(dá)到最大，胞苷到胞苷酸的摩爾得率為96%。結(jié)果表明，堿性條件下兩種固定化酶的催化活力明顯高于酸性條件。

2.4.3 溫度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響

按照1.5的方法配制催化反應(yīng)體系，底物胞苷和六偏磷酸鈉的加入量分別為30 mmol/L和15 mmol/L，調(diào)節(jié)不同的反應(yīng)溫度，考察溫度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響。如圖6所示，當(dāng)溫度在25–37 ℃范圍內(nèi)變化時(shí)，產(chǎn)物胞苷酸濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，胞苷酸濃度達(dá)到最大，胞苷到胞苷酸的摩爾得率為95%。雖然UCK來(lái)源于Thermus thermophilusHB8，可以在高溫下保持酶的活力，但反應(yīng)中另一種酶PPK來(lái)源于Rhodobacter sphaeroides，當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃時(shí)，該酶的催化活力會(huì)有所下降，從而導(dǎo)致固定化酶催化反應(yīng)效率的降低。

圖5 pH值對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of pH value on the catalytic reaction of immobilized enzymes.

圖6 溫度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the catalytic reaction of immobilized enzymes.

2.4.4 底物濃度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響

按照1.5的方法配制催化反應(yīng)體系，考察底物胞苷和六偏磷酸鈉的加入量對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響。如表2所示，考察底物胞苷濃度在30–150 mmol/L范圍內(nèi)固定化酶的催化效率。從表中可以看出當(dāng)?shù)孜锇諠舛仍?0–60 mmol/L之間時(shí)，胞苷酸的摩爾得率維持在96%的水平，當(dāng)?shù)孜锇諠舛瘸^(guò)60 mmol/L時(shí)，固定化酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物摩爾得率逐漸下降。此外，提升六偏磷酸鈉的濃度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)影響不大。

2.5 利用固定化酶多批次催化制備胞苷酸

使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，進(jìn)行多批次催化反應(yīng)制備胞苷酸。如表3所示，隨著反應(yīng)次數(shù)的增多，固定化酶的催化反應(yīng)效率逐漸降低。前5批次反應(yīng)胞苷酸的摩爾得率能夠維持在80%以上，平均摩爾得率為91.2%，第6批次反應(yīng)胞苷酸的摩爾得率降至52%。通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)反應(yīng)液中游離蛋白的濃度變化發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)過(guò)程中，部分重組酶會(huì)從固定化載體上脫落，從而導(dǎo)致固定化載體上的載酶量逐漸下降。這一方面是由于反應(yīng)過(guò)程中其他離子會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地替換Ni2+，另一方面則是由于反應(yīng)過(guò)程中樹(shù)脂之間或樹(shù)脂與瓶壁之間的摩擦引起的固定化載體破碎。

表2 底物濃度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)的影響Table 2 Effect of substrate concentration on the catalytic reaction of immobilized enzymes

表3 利用固定化酶多批次催化反應(yīng)制備胞苷酸Table 3 Production of CMP by multiple batch reaction using immobilized enzymes

3 結(jié)論

胞苷酸是一種重要的核苷酸產(chǎn)品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應(yīng)用于不同領(lǐng)域?，F(xiàn)有的胞苷酸生產(chǎn)方法主要包括核酸水解法和化學(xué)合成法，但生產(chǎn)過(guò)程繁瑣且非環(huán)境友好。酶催化法具有反應(yīng)條件溫和、底物特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，已逐步取代傳統(tǒng)方法用于胞苷酸的制備。已有研究表明，核苷酸代謝補(bǔ)償途徑中存在的UCK可以催化尿苷和胞苷磷酸化成為尿苷酸和胞苷酸，但反應(yīng)過(guò)程需要NTP作為磷酸供體。Qian等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和保加利亞乳桿菌來(lái)源的UCK催化胞苷酸合成時(shí)需要使用GTP作為磷酸供體，為了降低GTP的使用量，可以使用乙酸激酶催化乙酰磷酸和GDP生成GTP。使用上述體系反應(yīng)6 h可以催化30 mmol/L的胞苷和0.5 mmol/L的GTP生成29.1 mmol/L的胞苷酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%。但上述偶聯(lián)反應(yīng)中用于GTP再生的乙酰磷酸屬于極易分解的化合物，難以長(zhǎng)時(shí)間貯存且使用量大 (與胞苷的摩爾比為1.5∶1)，嚴(yán)重影響大規(guī)模生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

本研究使用Thermus thermophilusHB8來(lái)源的UCK用于胞苷酸的催化合成，證實(shí)了該酶可以以ATP作為磷酸供體，與GTP相比更為廉價(jià)。使用Rhodobacter sphaeroides來(lái)源的PPK催化六偏磷酸鈉和ADP生成ATP，證實(shí)了該酶可以高效保障偶聯(lián)反應(yīng)中ATP的循環(huán)再生。六偏磷酸鈉是常見(jiàn)的磷酸鹽，穩(wěn)定性強(qiáng)且使用量較少 (與胞苷的摩爾比為0.5∶1)。

為了增加酶的重復(fù)利用率，本研究利用親和層析的原理，使用Ni2+活化的金屬螯合樹(shù)脂為固定化載體特異性吸附重組蛋白，在純化重組蛋白的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了固定化，與常規(guī)的海藻酸鈣包埋法相比，操作更為簡(jiǎn)單且固定化酶的比活力更高。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，使用固定化酶以60 mmol/L胞苷和0.5 mmol/L ATP為底物，可實(shí)現(xiàn)5批次的高效連續(xù)催化反應(yīng)，胞苷酸平均摩爾得率達(dá)到91.2%。為了進(jìn)一步提高固定化酶的使用率，后期可以選擇其他類別的金屬螯合樹(shù)脂或者金屬離子，也可以調(diào)整重組蛋白上攜帶的標(biāo)簽數(shù)量，提升固定化載體與重組蛋白結(jié)合的牢固程度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本研究開(kāi)發(fā)的固定化酶制備胞苷酸的方法具有反應(yīng)成本低、操作性強(qiáng)、反應(yīng)周期短、環(huán)境友好等特點(diǎn)，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛質(zhì)。