孫瑞彬 高夢舒 王茜

摘要：為了探究強(qiáng)壯硬毛藻（Chaetomorpha valida）的開發(fā)利用價(jià)值，采用糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法測定強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖的組成，分別用硫酸-咔唑法、硫化鋇-明膠比濁法測定糖醛酸、硫酸基含量，同時(shí)通過強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除作用來評價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖中主要的單糖鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖的物質(zhì)的量之比為 1.00 ∶ 0.11 ∶ 0.21;多糖中糖醛酸、硫酸基含量分別為5.27%、3.77%;當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對DPPH·和超氧陰離子自由基的清除率最高，分別為84.5%、83.61%;當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，對羥自由基的清除率最高，為19.9%。由研究結(jié)果看出，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖能用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：強(qiáng)壯硬毛藻;多糖;組成;理化性質(zhì);抗氧化活性

中圖分類號： S184 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0206-06

收稿日期：2019-06-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31572622）;山東省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)建設(shè)計(jì)劃開放課題（編號：SDKL2017009-03）;國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號：MBSMAT-2018-04）;煙臺大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201811066145）。

作者簡介：孫瑞彬（1998—），女，山東煙臺人，主要從事海洋生物活性物質(zhì)研究。E-mail：15192344844@163.com。

通信作者：邢榮蓮，博士，副教授，主要從事海洋生物工程研究。E-mail：xingronglian@163.com。 ?海洋藻類生物的生存環(huán)境異于陸生植物，其代謝產(chǎn)物具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物活性[1]。海藻多糖具有抗氧化、抗病毒、抗細(xì)菌、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等功效，被廣泛應(yīng)用于藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域[2]。隨著人們對抗氧化劑的認(rèn)識加深以及對藻類多糖功能研究的發(fā)展，尋找天然無毒、價(jià)廉易得的抗氧化劑已經(jīng)成為食品保藏技術(shù)和現(xiàn)代保健中不可或缺的一部分[3]。從豐富的海藻資源中尋找能開發(fā)成為天然抗氧化劑的物質(zhì)已經(jīng)受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[4]。藻類多糖的研究及應(yīng)用以常見種類的微藻和大型藻類為主[5]。研究發(fā)現(xiàn)，藻類多糖的結(jié)構(gòu)組成、理化性質(zhì)和活性因種類而異。馬尾藻中的多糖主要有褐藻糖膠、藻酸鹽和褐藻淀粉3類，并且從不同種馬尾藻中提取的褐藻糖膠、藻酸鹽的質(zhì)量均有顯著差異[6];海帶硫酸多糖清除1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）的效果比紫菜硫酸多糖好[7];用碳酸鈉提取的羊棲菜多糖對自由基的清除效率比較高[7]。研究不同藻類多糖的組成、理化性質(zhì)和活性對于認(rèn)識該藻多糖的性質(zhì)及其開發(fā)利用具有十分重要的意義。

強(qiáng)壯硬毛藻（Chaetomorpha valida）是一種生長速度快、易采收、不易分解的可再生資源，因不能被生物直接攝食而成為相對靜止水體（池塘、湖泊）中的雜藻[8-9]，在每年5—9月大量繁殖甚至暴發(fā)[10]。養(yǎng)殖水體中發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)壯硬毛藻通常采用人工撈取后丟棄的方式處理，不僅對環(huán)境造成污染[11]，對資源也造成極大的浪費(fèi)[10]。研究強(qiáng)壯硬毛藻的應(yīng)用價(jià)值，對于提升經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義，但目前的相關(guān)研究甚少。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)壯硬毛藻含有大量多糖，而對其多糖的相關(guān)研究還未見報(bào)道。因此，本文研究了強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖的組成、理化性質(zhì)和抗氧化活性，并探討其利用價(jià)值，旨在為強(qiáng)壯硬毛藻資源的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

強(qiáng)壯硬毛藻采自山東東方海洋科技股份有限公司乳山分公司海參養(yǎng)殖區(qū)，帶回實(shí)驗(yàn)室后去除附著于其上的貝類、藻類等，用過濾海水洗凈，晾干，粉碎，備用。試驗(yàn)中所用標(biāo)樣為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純無水葡萄糖。

1.2 多糖的提取

稱取10 g強(qiáng)壯硬毛藻粉，加入200 mL蒸餾水，沸水浴提取2 h，重復(fù)操作3次，合并提取液。于 3 000 r/min 離心 20 min 以去除不溶性雜質(zhì)，將上清液冷卻后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀后離心，得強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖。再將強(qiáng)壯硬毛藻粗糖用Sevage法[12]去除其中的蛋白質(zhì)。

1.3 理化性質(zhì)的測定

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[13]，糖醛酸含量的測定采用硫酸-咔唑法[14-15]，硫酸基含量的測定采用氯化鋇-明膠比濁法[14-15]。單糖組分的分析采用糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法[16]。準(zhǔn)確稱取15 mg硬毛藻粗多糖樣品，加入10 mL濃度為 2 mol/L 的三氟乙酸于磨口試管中溶解，嚴(yán)格密封，在沸水浴條件下水解4 h，將水解液真空蒸干待用。稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)糖和上述處理好的糖樣10 mg，分別加入10 mg鹽酸羥胺、0.5 mL吡啶、1 mg肌醇，充分溶解振搖后于90 ℃水浴中加熱反應(yīng)30 min，取出混合液并冷卻至室溫，再加入0.5 mL乙酸酐，在90 ℃水浴條件下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙?；?，將反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)行氣相色譜分析。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 多糖對超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）的清除作用 取1 mL質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖溶液，加入4.6 mL濃度為 0.05 mol/L 的Tris-HCl（pH值為8.2），在25 ℃水浴中恒溫10 min，立即加入0.3 mL濃度為 0.06 mol/L 的鄰苯三酚溶液，搖勻，10 min后在 420 nm 波長處測得吸光度D420 nm（1）。保持其他條件不變，以等體積的去離子水代替多糖樣品溶液作為空白對照，測得吸光度D420 nm（0）[17]。以不同濃度維生素C替代多糖樣品作為陽性對照。超氧陰離子清除率的計(jì)算公式如下：

1.4.2 多糖對羥自由基（·OH）的清除作用 取 2 mL 質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的多糖溶液，分別加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 0.06 mol/mL H2O2溶液，搖勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液靜置30 min，在510 nm處測得吸光度D510 nm（i）。其他條件不變，對照用去離子水代替多糖樣品溶液，測得吸光度D510 nm（x）;樣品對照用2 mL去離子水代替H2O2，測得吸光度D510 nm（j）[18]。用不同濃度的維生素C替代多糖樣品作為陽性對照。對羥自由基（·OH）清除率的計(jì)算公式如下：

式中：D510 nm（j）為2 mL各濃度多糖溶液、2 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）、2 mL去離子水和2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L）的吸光度;D510 nm（i）為待測組吸光度。

1.4.3 多糖對DPPH·的清除作用 取2 mL質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖溶液，加入2 mL 0.2 mol/L DPPH溶液和2 mL H2O2溶液，搖勻，室溫避光靜置20 min，用95%乙醇對分光光度計(jì)調(diào)零，在517 nm處測得吸光度D517 nm（a）[18]。用不同濃度維生素C替代多糖樣品作為陽性對照。對DPPH·清除率的計(jì)算公式如下：

式中：D517 nm（c）為2 mL DPPH溶液+2 mL去離子水的吸光度;D517 nm（b）為2 mL 95%乙醇+2 mL多糖樣品溶液的吸光度;D517 nm（a）為待測組吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007和Origin 8.5軟件進(jìn)行處理和分析，結(jié)果以“x±s”形式表示。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析來檢驗(yàn)有無顯著性差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)的測定

結(jié)果表明，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖總糖含量為 26.77%，糖醛酸含量為5.27%，硫酸基含量為 3.77%。用氣相色譜法測得強(qiáng)壯硬毛藻單糖的色譜結(jié)果和3種標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜結(jié)果，詳見圖1至圖4。圖3中的峰對應(yīng)巖藻糖和本試驗(yàn)中所加參照物。由圖1至圖4還可看出，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖的主要成分為鼠李糖、葡萄糖和巖藻糖，鼠李糖、巖藻糖、葡萄

糖物質(zhì)的量之比為1.00 ∶ 0.11 ∶ 0.21，鼠李糖占比最高，約為葡萄糖的5倍，遠(yuǎn)高于其他單糖。

2.2 粗多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖5可以看出，不同質(zhì)量濃度粗多糖對超氧陰離子自由基的清除作用與維生素C相比差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度為0.8～1.0 mg/mL時(shí)，清除率較高，當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，有最大清除率，達(dá)83.61%;當(dāng)粗多糖、維生素C質(zhì)量濃度為0.2～0.8 mg/mL 時(shí)，相同質(zhì)量濃度的粗多糖、維生素C間對超氧陰離子的清除作用差異極顯著（P<0.01）;當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL時(shí)，差異顯著（P<0.05）。

2.3 粗多糖對羥自由基的清除作用

經(jīng)方差分析，不同質(zhì)量濃度粗多糖對羥自由基的清除作用差異顯著（P<0.05）。由圖6可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL時(shí)，粗多糖對羥自由基的清除率差異不明顯且均不超過50%;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4～1.0 mg/mL時(shí)，相同質(zhì)量濃度的粗多糖和維生素C對羥自由基的清除作用差異極顯著（P<0.01）;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，粗多糖、維生素C對羥自由基的清除作用差異顯著（P<0.05）。

2.4 粗多糖對DPPH·的清除作用

經(jīng)方差分析表明，不同質(zhì)量濃度粗多糖對DPPH·的清除作用差異極顯著（P<0.01）。由圖7可知，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對DPPH·有較好的清除作用。強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對DPPH·的清除率隨粗多糖質(zhì)量濃度的升高而增大，1.0 mg/mL質(zhì)量濃度的粗多糖對DPPH·的清除率最高，達(dá)84.5%;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2～0.8 mg/mL時(shí)，相同質(zhì)量濃度的粗多糖和維生素C對DPPH·的清除作用差異極顯著（P<0.01）;當(dāng)粗多糖、維生素C質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL 時(shí)，清除率間差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法試驗(yàn)結(jié)果顯示，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖的組成成分非常簡單，以鼠李糖為主，其中鼠李糖具有提高免疫力、保護(hù)肝臟器官、減輕疲勞感等功能[19]。強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖中鼠李糖含量較高，預(yù)示該粗多糖在藥品、食品、保健品、化妝品等方面具有應(yīng)用潛能。超氧陰離子是一種活性氧，對機(jī)體中的蛋白質(zhì)、酶和DNA有一定的損害作用，超氧陰離子過多時(shí)，會損傷細(xì)胞或造成機(jī)體衰老、患癌等，而多糖可與超氧陰離子發(fā)生氧化反應(yīng)，清除超氧陰離子，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷，起到抗氧化的作用[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖具有一定的去除超氧陰離子的能力，而且高濃度的強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對超氧陰離子的清除作用較強(qiáng)，能夠起到良好的抗氧化作用。當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度在0.6～0.8 mg/mL間增加時(shí)，粗多糖清除超氧陰離子的能力隨羥基數(shù)量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度較低時(shí)，羥基數(shù)量減少，而且由于羥基包裹在內(nèi)部，與超氧陰離子結(jié)合的能力較弱，可能導(dǎo)致清除能力較低[23]。當(dāng)粗多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到08 mg/mL時(shí)，粗多糖溶液提供的羥基數(shù)量迅速增多，使超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的化合物，因此對超氧陰離子的清除率升高。紅藻如江蒿多糖對超氧陰離子的清除率達(dá)56.2%，蜈蚣藻多糖對超氧陰離子的清除率也達(dá)59.0%[24]。綠藻中南方團(tuán)山藻多糖對超氧陰離子的清除率最高可達(dá)90%以上，石莼可達(dá)40%以上[25]。當(dāng)質(zhì)量濃度為 0.02 mg/mL 時(shí)，7種不同分子量的褐藻巖藻多糖對超氧陰離子的清除率均高于50%[26]，表明強(qiáng)壯硬毛藻與其他綠藻、紅藻和褐藻對超氧陰離子都具有一定的清除能力，可以代替紅藻、褐藻或其他綠藻應(yīng)用于食品制造工藝等多個(gè)領(lǐng)域。

羥自由基是一種活性氧，屬于強(qiáng)氧化劑，可與多種成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，過量的羥自由基會對機(jī)體造成一定的氧化損傷[27-28]。與超氧陰離子相比，羥自由基對生物體的毒性更強(qiáng)，危害更大[29-30]。金屬離子可以和硫酸基發(fā)生螯合反應(yīng)，使羥自由基的生成受到抑制[31]。強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖中的硫酸基含量較少，與金屬離子的螯合作用較弱，影響了羥自由基的清除作用。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定程度時(shí)，硫酸基的減少，可能導(dǎo)致羥自由基清除率在粗多糖質(zhì)量濃度較低時(shí)（0.2～0.4 mg/mL）迅速下降。本試驗(yàn)采用強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖為樣品，由于分子量對多糖的生物活性有一定影響，分子量大的多糖的抗氧化活性可能略低于分子量小的多糖[21]，可能導(dǎo)致強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對羥自由基的清除能力較弱，硫酸根含量較低也可能是影響強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對羥自由基的清除能力的原因之一，可見在清除羥自由基方面，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖效果較弱。綠藻中的南方團(tuán)扇藻和石莼對羥自由基的清除率分別為50%、40%以上[25]。紅藻中的紅蒿對羥自由基表現(xiàn)出了較高的清除能力[24]。褐藻巖藻多糖對羥自由基的清除作用也較強(qiáng)，當(dāng)清除率達(dá)到90%時(shí)，其所需多糖的質(zhì)量濃度相對較低，分子量為64.3 ku的多糖僅需0.89 mg/mL[26]。由此可以看出，強(qiáng)壯硬毛藻與其他綠藻對羥自由基的清除能力相當(dāng)，且強(qiáng)壯硬毛藻原料來源豐富、易大量繁殖，且價(jià)廉，也可以作為其他綠藻、紅藻及褐藻的替代品或在不同領(lǐng)域使用。

DPPH是一種具有單電子、穩(wěn)定的、以氮為中心的化合物[32]。試驗(yàn)結(jié)果表明，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對DPPH·的清除效果明顯，清除率較高，抗氧化活性較高。由于多糖濃度升高時(shí)，硫酸基、糖醛酸含量增多，多糖的電負(fù)性增強(qiáng)，抗氧化活性隨之增強(qiáng)，清除能力也有所提高[21]。綠藻中南方團(tuán)扇藻、石莼對DPPH·的清除率分別為70%、20%[25]。紅藻江蒿、仙菜對DPPH·也具有一定的清除能力，清除率分別可達(dá)57.4%、60%[24]。褐藻泡葉藻多糖對 DPPH· 的清除能力較弱，在質(zhì)量濃度為0～0.8 mg/mL 的范圍內(nèi)對DPPH·的清除率均不超過30%。強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)對DPPH·的清除率已超過30%[33]。以上結(jié)果表明，強(qiáng)壯硬毛藻相較于其他綠藻、紅藻及褐藻對DPPH·具有更好的清除能力，可用作食品添加劑或應(yīng)用到生物制藥等多個(gè)領(lǐng)域。

由此可見，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖對羥自由基的清除能力小于對DPPH·和超氧陰離子自由基的清除能力，但仍具有良好的抗氧化活性。過量的自由基對多種生物具有極大的危害，會加速機(jī)體老化甚至引起多種嚴(yán)重疾病，如腫瘤、癌癥[34]。紅藻多糖的突出抗氧化活性在清除自由基、防止自由基損傷方面具有較好效果[24]，現(xiàn)已被應(yīng)用于功能性食品添加劑和營養(yǎng)保健品技術(shù)等領(lǐng)域。研究證明，馬尾藻、石莼、羊棲菜等海藻多糖已成為涂膜保鮮原材料中的新焦點(diǎn)[35]。褐藻巖藻多糖在食品、保健品和制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[26]。由上述結(jié)果看出，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖與部分紅藻、褐藻和綠藻等都具有相當(dāng)?shù)目寡趸芰?，且?qiáng)壯硬毛藻也有豐富價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，因此強(qiáng)壯硬毛藻同樣可以應(yīng)用于功能性食品添加劑生產(chǎn)、保健品技術(shù)、食品涂膜保鮮及制藥等多個(gè)領(lǐng)域。

本研究結(jié)果表明，強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖提取率較高，抗氧化活性較強(qiáng)。因此將強(qiáng)壯硬毛藻粗多糖應(yīng)用到食品、保健品、化妝品以及生物制藥等領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景。

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